本文是一篇农业论文，本文主要是利用本土荷斯坦品种奶牛，对其生产的牛乳进行牛乳蛋白基因分型检测，并开展牛乳凝乳性能筛选，针对筛选出的具有特征型牛乳进行牛乳成分及理化特性检测、牛乳基因型及凝乳频率、凝乳动态流变学和乳蛋白多态性等方面检测。
1 绪论
1.1 概述
1.1.1 牛乳及干酪产品营养价值研究
牛奶属于复合胶体溶液中的一种，牛乳的俗称，其中富含的蛋白质、脂肪、乳糖、维生素、无机盐、酶等多种微量成分的乳汁[1]，牛乳是自古以来存在时间最长的“天然饮料”，其中的蛋白质、氨基酸以及乳脂肪等是属于易被人体吸收并且利用的物质[2]。人类在生长及正常生活过程当中急需各种营养物质，钙元素是非常重要的一种矿物质，只有以化合态形式存在的 Ca2+才能被人体吸收，恰恰牛乳中含有丰富的活性钙，是人们最好的钙质来源之一[3]。并且牛乳还具有补肺养胃等药性功效，还有美容养颜、促进骨骼发育等功效。
荷斯坦牛到目前为止，是世界上现存分布最广且饲养量最多的奶牛品种，荷斯坦牛乳中的乳脂、乳蛋白含量分布比较均衡，一般的乳脂率约为 3.65%，乳蛋白含量约为 3.25%[2]。荷斯坦奶牛的优势主要有每头牛的产奶量高、并且饲料的利用率较高、在多种环境都能适应生长[4]。本土荷斯坦奶牛主要是指我国本土的黄牛和从国外不同品种引入的原始荷斯坦牛经过长时间培育制成的一个杂交品种[5]。国外已经有相关人员研究并比较了牛乳中蛋白质、脂肪、其他成分的相关理化特性，经研究检测发现，不同哺乳动物的分泌物之间存在许多不同之处，主要体现在品种、地域、泌乳时间、气候、饲养条件等因素影响着它们的哺乳期、固形物含量、蛋白质、脂肪、乳糖等方面[6]。目前在市场上比较流行的 4 种动物奶的营养组成比较见表 1.1。除了营养组成之间的差异，其理化特性及凝乳等相关特性上也存在着些许差异，本文主要在凝乳方面进行论述。
个体编码的多态性、年龄、喂养及身体状况、泌乳期等因素都会导致其分泌乳的乳清蛋白和酪蛋白含量之间的差异，有研究也证明了乳蛋白基因多态性关于泌乳性能之间具有显著相关性[7]，对生长发育也有一定的影响，这种差异也是导致其在制作乳酪过程中存在凝乳效果差，从而导致产量不一、产品品质下降等情况出现。
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1.2 国内外凝乳机制影响因素的研究现状
干酪的制作过程需要牛乳的凝固和脱水两个主干步骤。牛奶凝固特性（MCP）受到了乳品行业的极大关注，主要是因为用于奶酪生产的牛奶量在全球范围内不断增长（国际乳品联合会，2011 年）。在过去的十年中，欧盟和北美地区用于奶酪生产的牛奶占总牛奶的比例增加了约 10%，超过 36%的牛奶被加工成奶酪制品（国际乳品联合会，2016 年），这一比例在过去十年中增加了 23%，而我国干酪的年产量约为 3 万吨，进口约为 8 万吨[32]。伴随着西餐及洋式餐饮在我国的流行，干酪也成为了现代年轻人群的新宠，在如此大大消费的市场环境下牛奶加工业将从牛奶干酪制造性能的改善中获得巨大的经济效益。
牛奶凝乳是一种用于生产酸奶及干酪这类发酵乳制品的生产工艺过程中的一个重要步骤。在使用了凝乳酶或者发酵剂之后，凝乳差或者不凝乳现象的出现将会严重影响到该产品的得率以及其品质[13]。在如今市场上对抗生素残留的严格管控下，仍会出现不凝乳或凝乳性差的现象，受奶牛品种差异以及奶牛个体之间的遗传差异的影响，在品种和个体之间牛乳的 MCP 差别很大，Tervala 等人[33]发现约有 30%的表型上的差异，实质上是由于遗传因素造成的。最近几年，有意大利和芬兰的研究者想要通过对奶牛遗传形状的改良，进而有效地改善了牛乳的 MCP，实验通过选用本地的荷斯坦奶牛和黑白花奶牛作为实验对象，通过对多项实验的结果分析发现，κ-酪蛋白对牛乳的凝乳能力有重要影响[33, 34]。另有研究表明，不同品种之间即使产量相似，其 MCP 的差别依旧很大，例如芬兰地区的 Holstein-Friesian 所产的奶，并且其干物质含量也很高[35]。还有更深入的研究表明，干物质的含量与牛乳中酪蛋白的含量成正比关系，这类牛乳多与κ-酪蛋白的 B 等位基因相关[36]。研究发现约有超过 10%的奶牛（包括丹麦、荷兰等国家的荷斯坦奶牛，Jersey 奶牛等）所产牛乳的凝乳时间都比较短，并且约有 2.0%~4.0%的奶牛所产的牛乳为 NC 乳[14]，MCP 是决定牛奶转化为奶酪比例的一个重要因素。
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2 材料与方法
2.1 样品来源
原料牛乳及血样：采用北京三元绿荷南口奶牛三场、昌平区南口二场、三石牛场、王庄牛场等牛场的原料乳。与各牛场制定采样计划，所有牛场均按照计划进行，确保取样的同时能最大限度地提高遗传多样性以及牛奶成分的变化。
表 2.1 主要试剂材料
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2.2实验方法
2.2.1 样品采集
2.2.1.1 血样采集
通过对北京三元绿荷南口奶牛三场等牛场的 3625 头母牛系谱分析，采集了其后代 16 月龄大青年、一胎、二胎母牛血样并提取 DNA。取样的目的是最大限度地提高遗传多样性以及牛奶成分的变化。
2.2.1.2 牛乳采集
乳样采用初筛和复筛的方法，对采集样品进行层次筛选。在北京三元绿荷南口奶牛三场，采集已知基因型的原料乳样品，每种基因型样品每次采集至少 30 份，每份50-100 mL，共 180 份；相同试验重复 3 次（每隔 15 天采集 1 次，共采集三次）。从中筛选出凝乳能力好、凝乳能力差及不凝乳每类至少 5 份样品；然后，重复采集选出的样本奶样 5 次（隔 3 天采集 1 次，每天采集早、中、晚三次，每次采集 100毫升）。在 2000×g，4℃下离心 30min 脱去脂肪后，用-80℃冰箱冷冻保存用于后续分析。
2.2.1.3 凝乳能力判定标准
按照凝乳时间来划分凝乳等级，凝乳时间在 18min 以内、能形成坚固立方体的划分为凝乳性能好（WC）乳样，凝乳时间在 18-30min 之内、形成较柔软立方体的划分为凝乳性能差（PC）乳样，凝乳时间大于 30min 的乳样即为不凝乳样（NC）[14, 17]。
2.2.2牛乳蛋白基因型分析检测
将采集的血样使用竞争性等位基因特异性 PCR 对样本进行分型，之后利用 KASP（Competitive Allele Specific PCR）技术对其进行了 CSN3（κ-CN）和 BLG（β-LG）基因分型检测。通过蛋白酶 K 消化，使用苯酚-氯仿从血液样本中分离 DNA，使用MassARRAY iPLEX 受体型蛋白酪氨酸磷酸酶分析对 DNA 进行了基因分型[40]。从公开来源汇编了 80 个 SNP，包括 CSN3 和 LGB，仅对次要等位基因频率大于 0.05 且检出率至少为 90％的 SNP 进行进一步分析[38, 41]。κ-CN 的主要复合基因型为 AA、AB、AE、BB、BE、EE，β-LG 的主要复合基因型为 AA、AB、BB。
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3 结果与分析...............................19
3.1 基因多态性对凝乳性能的影响............................. 19
3.1.1 牛乳基因型与频率及凝乳频率之间的关系................................19
3.1.2 不同基因型牛乳成分差异及理化特性对凝乳性能的影响............................21
3.1.3 牛乳蛋白基因型对牛乳凝胶特性的影响............................23
4 结论................................38
3 结果与分析
3.1 基因多态性对凝乳性能的影响
3.1.1 牛乳基因型与频率及凝乳频率之间的关系
造成乳蛋白内部存在一些基因多态性的原因是由于乳蛋白内部的氨基酸序列不同，而造成氨基酸序列差异的原因是主要是由于乳蛋白内部核酸序列中的一些特定基因的变异[35]。到目前为止，国内外的有些研究者分别从 DNA 水平和蛋白水平对乳蛋白基因的多态性进行了相关研究[41]。本研究从 DNA 水平进行检测，血样采集结果显示，CSN3 基因涉及 4 个 SNP 位点，BLG 基因涉及 2 个 SNP 位点，其中 CSN3 基因有 AA、AB、AE、BB、BE、EE 六种基因型，BLG 基因型有 AA、AB、BB 三种基因型。
表 3.1 所示是牛场现有奶牛中已知的基因型及频率，κ-CN 和β-LG 的乳蛋白基因型存在比例上的差异。从表 3.1 中也可以看出，酪蛋白和乳球蛋白的不同基因型牛乳的凝乳频率也是存在明显差异的。分泌κ-CN AB 基因型牛乳的母牛所占比例最高，频率为 39.70%，在κ-CN 的 AB、BB、BE 基因的总体凝乳效果是较好的，凝乳频率都达到了 70%以上。等位基因 B 对凝乳有积极作用[61]，与 AB 型相比，BB 基因型更能提高干酪产量，而等位基因 A 对凝乳产生消极作用。κ-CN EE 在整体牛群中比例含量最少，考虑到母牛的更替换代，所以在后续分析处理中并未对此基因型列入到数据库中；在所有奶牛组中最常见的β-乳球蛋白基因型是 AB[66], 频率为 48.48%，β-乳球蛋白的 AA 和 BB 基因型的凝乳效果良好，凝乳频率都超过了 80%，而 AB 基因型有 33.01%的牛乳凝乳性能很差，有 7.56%的牛乳不凝乳，这就导致了其整体的凝乳能力大大减弱。β-LG AA 基因型的优质
