实验初进行血液的PCR-RFLP检测时,采用一步PCR,用T 5%、C 3%的PAGE检测获得明确的谱带分型,但毛发、骨骼检验的一次PCR扩增产物少,电泳谱带密度低,不易判型,经引用巢式PCR后,分型效果好。巢式PCR(Nest-PCR)或叫嵌合PCR,是进行二次PCR扩增,第二次PCR以第一次PCR产物为模板,选用第一轮PCR引物内侧的序列为引物进行PCR扩增,第一次PCR扩增产物中部分序列得到第二次扩增,明显提高了检测的灵敏度,巢式PCR主要用来提高扩增灵敏度和特异性[6]。进行毛发、骨骼检验时由于DNA模板量偏低,经过以目的片段15997-16401nt引物外围序列15965-16491nt作为引物进行第一轮扩增后,再以扩增产物为模板进行目的片段的扩增,电泳检测见明显405bp片段,谱带密度高,提高了扩增的灵敏度,扩增产物量大幅度提高。
另在进行酶切操作中发现有酶切不全的现象,经将酶切反应体系中RsaⅠ酶的含量由0·05μ/μl增加到0·25μ/μl后,解决了该问题。
鉴于mtDNA母系遗传的特征,同一母系的个体,mtDNA单倍型是一致的[3]。因此,在法医学个体识别中,主要作用是排除同一性[5],要求GD值较高,才能在实际案件检测中发挥作用。本文应用RsaⅠ单酶切,GD值为0·393,尚不能达到同一鉴定的要求。
如果再增加2~3个限制酶,所获单倍型数将会明显增加,提高GD值。
【参 考 文 献】
[1] Stoneking M, Hedgecock D, Higuchi RG,et al. PopulationVariation of human Mitochondrial DNA Control Region Se-quence Detected by Enzymatic Amplification and Sequence-specific Oligonucleotide Probes[J].Am JHum Genet, 1991,48: 370-382.
[2]郑秀芬.法医DNA分析[M].北京:中国人民公安大学出版社, 2002. 79-86.
[3]程宝文. PCR-RFLP检测线粒体DNA D-环多态性[ J].中国法医学杂志, 2000, 1(2)98-99.
[4]姜先华.线粒体DNA测序分析技术及其在毛干犯罪物证鉴定中的应用[A].首届中国刑事科学技术协会学术研讨会论文汇
