本文是一篇医学论文范文，本研究从基因水平证实了 DCLK1、TFPI2、ATXN1、COL1A2、EPHB2、DNAJC6、UPK3A 在不同成瘤性 MDCK 细胞间的差异，从蛋白水平证实了DCLK1、TFPI2 在同成瘤性 MDCK 细胞间的差异，成功构建一株 DCLK1 低表达的 MDCK 稳转细胞系及一株 DCLK1 过表达的 MDCK 稳转细胞，揭示了DCLK1 在 MDCK 细胞中起促瘤作用，表明了 ATXN1、EPHB2 及 UPK3A 在MDCK 细胞中与 DCLK1 存在调控关系。
第一章：绪论
1.MDCK 细胞成瘤性研究进展
MDCK 细胞系由 Madin 和 Darby 于 1958 年从美国 Cocker Spaniel 母曲架犬的肾脏中分离培育建立，该细胞系的建立过程并未在已发表的报告中进行描述，只报道了建立另外 2 个细胞系，即 Madin–Darby 牛肾细胞和 Madin–Darby 绵羊肾细胞，MDCK 在组织培养传代 49 时，MDCK 细胞系被提交动物细胞系注册处，由美国典型培养物保藏中心（ATCC）的前身细胞培养物保藏委员会认证，成为认证的细胞系，提交给 ATCC 的 MDCK 细胞的描述和条件由 Gaush 及其同事的报告代表了有关 MDCK 细胞的建立及早期传代历史和核型等可用信息[1]。MDCK通常是以贴壁方式生长的上皮样细胞，由于其病毒感染效率高、适应与无血清的生长条件、且增殖快、不易变异，MDCK 细胞系被公认为最适于生产流感病毒疫苗的细胞系之一[2-4]。因 MDCK 细胞本身具有成瘤性，用其生产疫苗的安全性一直存在着广泛的争议[5-6]。多年来，关于 MDCK 细胞的成瘤能力等数据一直存在矛盾，MDCK 细胞的成瘤表型是未知的，并且是当前研究的主题，表观遗传事件可能诱发上皮-间充质转化和间充质-上皮转化，据报道，这两种转变都在诱导干细胞特性，肿瘤发展以及侵袭和转移中起作用[1]。近年来，乔自林等通过单细胞克隆培养和筛选，得到了数株无成瘤性的 MDCK 细胞株（即将细胞注入裸鼠中，裸鼠在观察期内没有出现肿瘤）[7]，将其与实验室已有的高成瘤性细胞株一并做高通量分析发现，某些经典的肿瘤通路被靶基因激活了，其中 lnc RNAMSTRG.1056.2 直接调控 ERBB 3 激活了 PI3K-Akt 通路，促进了肿瘤的发生[8]。从长远来讲，为了保证疫苗的安全性，开发无成瘤性 MDCK 细胞系不仅可以减轻下游纯化工艺的难度，还可以从根本上降低以其生产流感疫苗后的接种风险，MDCK 细胞的成瘤性包括多个抑癌基因和成瘤相关基因的参与，从而导致了细胞机制发生改变，据报道，将癌基因 v-src 转染到 MDCK 细胞后下调了细胞间的粘附，并刺激胶原凝胶的侵袭，导致细胞表型发生了上皮-间充质表观遗传学的转变[9]。检测细胞表面明胶酶 A 的受体 MT1-MMP 的表达，发现 MDCK细胞中原明胶酶 A 由潜伏状态变为活化状态，进而促进裸鼠成瘤[10]。另外，ADAMTS12 在 MDCK 细胞中可通过阻断 Ras-MAPK 信号通路的激活来阻止肝细胞生长因子 （HGF） 的成瘤作用，并且该调控涉及金属蛋白酶的血小板反应蛋白域，揭示了 ADAMTS12 金属蛋白酶通过调节依赖于 Ras 的 ERK 信号通路显示抗肿瘤的作用[11]。Galectin-8 是在人类组织和癌症中表达最广泛的半乳糖凝集素之一， 在之前的研究中 Galectin-8 具有抗肿瘤作用，诱导肿瘤细胞生长停滞和凋亡或抑其迁移和肿瘤的生长，但是将 Galectin-8 转染至 MDCK 中发现，Galectin-8 可以通过 FAK / EGFR / 蛋白酶体途径诱导部分上皮 - 间质转化，具有侵袭性成瘤能力[12]。
............................
2.MDCK 在疫苗生产中的研究进展
每年的流感流行在发达国家和发展中国家都继续产生相当大的影响，疫苗接种仍然是预防季节性流感并降低相关发病率和死亡率的主要措施，传统的流感疫苗生产多采用鸡胚培养过程，但该生产过程具易受微生物污染、内毒素残余量高、对流感大流行应急能力差等缺点，因此动物细胞制病毒疫苗工业的发展变得尤为重要，MDCK 细胞具有培养容易、对多种不同亚型的流感病毒株敏感、增殖快、流感病毒感染效率高等特点，是适合用作流感病毒疫苗生产的重要细胞系之一[13-14]。
2.1 国外对 MDCK 在疫苗生产中的研究进展
1977 年，开发了使在无血清条件下生长的 MDCK 细胞的组织培养方法，以生产灭活的流感亚单位疫苗，最初的临床数据表明它与常规的鸡胚流感亚单位疫苗相同，并且符合欧洲共同体“流感疫苗要求统一”中所述的免疫原性标准[15]。1999 年，从可育鸡卵（鸡蛋）和 MDCK 细胞中的临床咽拭子中分离出甲型和乙型流感病毒，然后将其用于上述两个宿主的后续疫苗生产中，基于 H I 滴度的免疫反应的时程表明，MDCK 细胞衍生的疫苗引起了极高的抗体水平，由 MDCK细胞生长的 H3N2 疫苗产生的抗体与由鸡蛋生长的病毒制备的疫苗非常相似，通过评估免疫反应，当改善 B 病毒疫苗的弱免疫原性时，源自 MDCK 细胞的流感疫苗可能仍然有用[16]。1999 年，基于大规模细胞培养技术的流感疫苗生产技术，通过 MDCK 连续细胞系的表征以及药物安全性研究，得出该细胞系和细胞培养系统适用于生物生产的结论[17]。基于 WHO 极力推荐使用哺乳动物细胞替代鸡胚制备的流感疫苗 ，欧洲、中东和非洲（EMEA）批准了由诺华疫苗公司（ NovartisVaccines ） 生产的 MDCK 细胞培养来源的流感疫苗 Optaflu[18]。可替代基于鸡蛋的疫苗生产[19]。基于细胞培养的生产方法可能有助于满足对季节性流感疫苗日益增长的需求，并提高应对流感大流行所需的生产灵活性， MDCK-33016PF 细胞用于繁殖基于细胞的季节性流感疫苗（Optaflu）；但是，像大多数连续细胞系一样，它们可以在免疫功能低下的小鼠中生长以产生肿瘤，因此，至关重要的是，疫苗中不应残留任何细胞，细胞裂解物 或 DNA 不具有致瘤性，并且细胞底物不包含致癌病毒或致癌 DNA，通过使用生产过程中使用的多个正交过程，使MDCK-33016PF 细胞生产季节性流感疫苗所产生的理论风险可降低至实际上为零的水平[20]。
...........................
第二章：DIA 组学技术分析 MDCK 细胞成瘤性相关蛋白
1方法
1.1MDCK 贴壁细胞培养
复苏 MDCK 贴壁细胞系于 T-25 方瓶中，同含 10%胎牛血清的 DMEM培养基培养，置于 37℃，5% CO 2 培养箱中培养。
本研究为了便于记录，将高成瘤性 MDCK 细胞 MDCK-A、 MDCK-B、MDCK-C 分别记为 HT01、HT02、HT03；将无成瘤性 MDCK 细胞 MDCK-CA005、MDCK-CB057、MDCK-CA082 分别记为 NT01、NT02、NT03。然后将样本中加入细胞裂解液后迅速进行超声裂解。在 4℃条件下 12000 rpm-14000 rpm 离心约 30 min，取其上清。用 BCA 法测定其蛋白含量。取 50 μg 蛋白质稀释至 50μL，加入 1M DTT 1μL，在 55°C 温育 约 1h。加入 1M 碘乙酰胺（IAA）5μL，室温避光约 1 h。加入 300μL 预冷的丙酮沉淀 约 2h，沉淀则用 Trypsin (Promega)酶解过夜。
将所有样品肽段混合物在 pH 为 10.0 的 20mM 甲酸铵水溶液中，重新溶解后用 Ultimate 3000 系统连接反向柱进行高 pH 线性梯度分离，40 min 内5%B 至 45% B (B: 80% ACN 中加入 pH 为 10.0 的 20mM 甲酸铵)，平衡15min，柱温 30℃柱流速维持在 1mL/min，收集到 6 个 fraction，各 fraction 在真空浓缩仪中干燥待用。
......................
2结果
2.1 DIA-MS 工作流程的实验设计和评估
蛋白质定性分析是确定样品中是否有蛋白质存在，以及鉴定蛋白质的种类。在图 1A 中，实验一式三份进行，即为每个组准备了三个的生物学重复样品（请参见“方法”），通过 DIA-MS 进行注射。进行了 DDA 分析以生成光谱库，共鉴定出 14717 种蛋白质。为了保证结果的可靠性，根据蛋白定性分析鉴定标准，按照 FDR ≤ 0.01 的过滤标准,结果鉴定出 92842 个独特肽段，并定量了 11359 个蛋白质（图 1B). 筛选 FDR < 1.0%的前 3 个 MS1 肽段的峰面积的平均值用来进行蛋白质的定量。 通过进行层次聚类分析和分析评估了 DIA-MS 工作流程的分析稳定性和可重复性,层次聚类分析结果表明，每个样本的技术重复都得到了很好的收集（图 1C）。并对检测到的蛋白用 GO、KEGG 和 COG/KOG 三个数据进行统计，共得到 10968 蛋白的定量数据（图 1D)。总之，所提出的 DIA-MS 工作流程是可重复的，可靠的，并且适用于蛋白质组学分析。
DIA-MS 工作流程的实验设计和评估
.........................
第三章：构建敲低及过表达 DCLK1 的 MDCK 稳转细胞系............. 26
1.材料..........................................26
1.1 主要试剂与材料....
