Abstract: Objective To explore the relationship between autistic disorder and friagile X mental ratardation 1(FMR-1) gene by de-tecting FMR-1 gene in children.Methods Using children-oriented questionnaire to investigate, then using child autism rating scale(CARS), autism behavior checklist(ABC) screen out dubious patient of autistic, finally to ensure the diagnosis of children with autisticdisorder was based on CCMD-3 criteria.Seventy-five outpatients were recruited from mental health center of Westchina hospital affilia-ted to Sichuan university. FMR-1 gene was detected in autistic children.Result The abnormal frequency of FMR-1 gene was verylow (1.3%) in children with autistic disorder.Conclusion There may be no correlative relationship between genetic pathogenesis ofautistic disorder and FMR-1 gene.
Key words:autistic disorder;child;polymerase chain reaction;gene; fragile X mental retardation 1
[摘要]目的 对孤独症儿童进行脆性位点精神发育迟滞1(FMR-1)基因检测,探讨儿童孤独症与FMR-1基因的关系。方法 孤独症患儿75例。用一般情况调查表进行调查,以儿童孤独症评定量表、孤独症行为检查量神经学论文范文表筛查可疑患儿,按照中国精神障碍分类与诊断标准第3版(CCMD-3)的儿童孤独症诊断标准进行诊断和FMR-1基因检测。结果 孤独症患儿FMR-1基因异常率极低,仅1.3%。结论 儿童孤独症遗传学发病机制可能与FMR-1基因无关。
[关键词]孤独症;儿童;聚合酶链式反应;基因;脆性位点精神发育迟滞1
儿童孤独症是一种起病于儿童期的严重精神疾病。对孤独症儿童进行脑电图研究提示,并癫的频率较高,脑电图可有样放电[1]。75%孤独症患儿伴精神发育迟滞。智力低下是导致孤独症儿童不良预后的重要因素。孙 凌等[2]对孤独症的病因学研究进行综述,提出脆性X阳性的孤独症患儿与非脆性X的孤独症患儿临床表现存在差异,推测脆性X阳性者可能是孤独症谱性障碍的一个特殊亚型,但也有人认为孤独症与脆性X综合征关系不大。导致结果不一致可能与诊断标准不同、表型不一致有关。本研究用含扩增GC酶及含内对照引物的PCR反应体系,对75例孤独症患儿进行脆性X智力低下脆性位点精神发育迟滞1 (FMR-1)基因检测,旨在探讨儿童孤独症与FMR-1基因的关系。
资料与方法
一、一般资料 2001~2004年在四川大学华西医院心理卫生中心及华西医院第二医院儿保科、神经内科门诊就诊,及在成都市爱慧学校和温江北斗星学校培训的孤独症患儿75例。用儿童一般情况调查表收集一般资料,用儿童孤独症评定量表(CARS)、孤独症行为检查量表(ABC)作为筛选工具,两者分值均达诊断界值(CARS≥30分,ABC≥68分),按照中国精神障碍分类与诊断标准第3版(CCMD-3)关于儿童孤独症诊断标准[3]确定研究对象。患儿的监护人均签订知情同意书。共收集孤独症患儿75例。男64例,女11例;就诊年龄(4.71±1.97)岁,85.3%在3岁以后就诊;发病年龄(1.71±0.53)岁;病程(3.27±1.98)年。
二、材料 PCR仪;凝胶成像系统,Tris(Sigma公司);蛋白酶K,SDS(Sigma公司);TaKaRa LA Taq TM with GC Buffer(包括TaKaRa LA Taq,2×GC Buffer I,2×GC BufferⅡ,dNTPMixture,6×loading Buffer, TaKaRa公司);琼脂糖(Sigma公司),2000 bp marker等。
三、方法 基因组DNA制备:采集孤独症患儿静脉血5mL,以0.5 mol/L EDTA 1 mL抗凝,立即置-20℃冷冻存放。按常规酚-氯仿法提取DNA。引物设计:按照文献[4]查找FMR-1基因(CGG)重复片断的引物序列及内对照引物序列。引物由上海捷贝思基因技术有限公司合成,并进行PAGE纯化。引物序列:FMR-1: 5′-GCTCAGCTCCGTTTCGGTTTCA-CTTCCGGT-3′,5′-AGCCCCGCACTTCCACCACCAGCTCCT-CCA-3′。FMR-1内对照(β珠蛋白):5′-GCCACTTTATCTC-CTCCAGT-3′,5′-AGCACTAGCTGCCTATTCCA-3′。FMR-1基因(CGG)n重复片断PCR扩增:25μL PCR反应体系:DNATemplate 10~800 ng;5 mmol/L 2×GC BufferⅡ(含Mg2+)12.5μL;2.5 mmol/L dNTP Mixture 4μL;25 pmol/μL primer各0.5μL;5 U/μL LA Taq 0.25μL,加超纯水至25μL。PCR反应条件:95℃变性7 min,97℃30 s,65℃30 s,72℃1 min(第二步到第四步40个循环),72℃5 min。电泳分离PCR产物:2.5%琼脂糖凝胶(已加入溴乙啶)电泳(150 V,50 min),紫外灯下观察判断片断长度(2000 bp marker),并摄影。
四、统计学处理 用SPSS 11.0软件进行单变量频数分析。
结 果
孤独症患儿FMR-1基因(CGG)n重复片断检测结果 见图1。75例患儿中,仅1例(1.3%)检测出CGG重复数大于200 bp而不能扩增,显示为全突变,余患儿PCR扩增产物片断在300~350 bp,CGG重复数小于50。
讨 论
脆性X综合征是常见的遗传性智力障碍性疾病,其遗传方式为X连锁不完全显性遗传,临床以智力低下、巨睾症、特殊面容、儿童孤独症样症状为特征[5]。1991年Verkerk等应用定位克隆法在Xq27.3处发现了FMR-1。现已确认,该基因与脆性X综合征有关,而FMR-1基因5′侧的(CGG) n结构扩展是95%以上脆性X综合征患者发病的分子遗传学基础[6]。脆性X综合征也可表现出孤独症样症状[7],0~16%孤独症患儿存在脆性X综合征细胞遗传学证据。目前,采用PCR扩增FMR-1(CGG)n重复区,检测CGG重复数的大小进行筛查是检测FMR-1基因是否正常的一种简便有效的手段[8,9]。在细胞遗传学上,主要是采取G显带技术来发现Xq27脆性位点,但该位点出现频率低,易产生假阴性。在分子遗传学上,用Southern Blot可以检测CGG扩增和甲基化,但需大量DNA和放射性同位素,花费高,周期长。本研究利用含内对照引物的扩增GC水平丰富酶的PCR反应体系进行PCR扩增,可筛选出正常、携带者及全突变者。本研究检测75例孤独症患儿,以探讨FMR-1基因与儿童孤独症的关系。
目前,我国尚无关于儿童孤独症FMR-1基因的检测报告。叶志纯等[10]对253例智力低下患儿进行FMR-1基因检测,检出脆性X综合征携带者(FMR-1基因前突变者)14例,脆性X综合征患儿(FMR-1基因全突变者)9例,阳性率达9.09%。在纳入本研究孤独症患儿血样中,检测出1例(1.3%)CGG重复数大于200而不能扩增,显示为全突变,余患儿PCR扩增产物片断在300~350 bp,CGG重复数小于50,显示正常。与Hallmayer发现的2%~5%孤独症患儿存在脆性X综合征的细胞遗传学证据有些差异。究其原因,除与细胞遗传学方法和分子遗传学方法的不同有关外,考虑与种族差异有一定关系。Klauck等[11]对131例儿童孤独症家系进行FMR-1的(CGG)n扩展重复区的研究,也认为儿童孤独症与FMR-1基因FRAXA多态性无关联,初步排除这个位点作为儿童孤独症候选基因的可能性。Gurling等[12]同年对25个孤独症及孤独症相关障碍的多发家系作了关于脆性位点的分析,发现仅有3个家系显示脆性位点阳性,认为大部分孤独症 及孤独症相关障碍的表型特征不能用脆性位点的改变来解释。本研究也发现典型孤独症患儿中FMR-1异常率较低,也可间接推测FMR-1作为儿童孤独症候选基因的可能性较小,与上述研究结果类似。
综上所述,虽然儿童孤独症和脆性X综合征均可表现孤独症样症状,但是儿童孤独症FMR-1异常率较低,这个位点作为儿童孤独症候选基因的可能性较小,儿童孤独症和脆性X综合征的遗传病因学机制可能不同。
[参考文献]
[1]刘晓燕.脑电图检查对小儿癫的诊断价值[J].实用儿科临床杂志,2004,19(4):244-246.
[2]孙
