本文是一篇农业论文，目前已有研究表明，表观遗传中 DNA 甲基化对苹果果皮的花青苷合成有调控作用。为更加全面地了解表观遗传修饰对苹果色泽的影响，本研究以苹果果皮 lncRNA为研究对象，初步证明 TCONS_00045933 及其 trans 作用靶基因 bHLH36 与果皮花青苷合成有一定的关联，但仍不清楚其在花青苷合成中发挥作用的具体机制，对于TCONS_00045933 调控 bHLH36 表达的机制也有待进一步阐明。
1 前言
1.1 ‘富士’苹果的概
1980 年，我国农业部有关专家从日本引入多个着色表现优秀的苹果苗木和接穗，其中包括‘长富 2 号’、‘秋富 1 号’、‘长富 6 号’等品种，种植在甘肃等多个试点进行观察研究[3]。‘富士’幼树具有生长量大、枝芽量多、总叶面积大等特点，这为其早结果和丰产奠定了基础。据统计，2005 年我国‘富士’苹果每公斤售价超过 5 元，产销率高达 98 %以上，为果农创收 2000 多万元。
苹果的外观色泽直接影响其商品价值，着色好的苹果更容易被消费者接受[4]。目前，我国已选育众多优系富士苹果芽变，主要分为片状（Blushed）着色和条纹（Striped）着色 2 种[5]。本实验在前人研究的基础上，针对 2 种不同色相的‘富士’苹果果皮花青苷合成相关的 lncR NA 进行研究，同时测定解袋后果皮色泽和花青苷含量的变化，以期通过上述研究，为苹果着色提供理论参考和实验依据。
1.2 苹果色泽及其影响因子
1.2.1 苹果的色泽差异
苹果色泽由果实底色和果面盖色共同组成，主要受遗传因素影响，根据色泽表现将苹果分为红色品种和非红色（黄色和绿色）品种。苹果果实底色的遗传是同时受多对基因控制的不完全显性遗传，表现为黄绿色、绿色、绿黄色、黄色等。苹果处于幼果期时，果实底色表现为绿色；当苹果进入成熟期，果实底色将出现三种变化：第一种是绿色完全消失，底色变为淡黄色、黄色或橙黄色；第二种是绿色不完全消退，底色表现为黄绿色或绿黄色；第三种是绿色不消退，底色仍为绿色或淡绿色。苹果果面盖色的遗传表现出质量遗传为主、数量遗传为辅的关系，可能因其他修饰基因的影响而出现淡红色、浓红色或部分着色等情况[6]。
苹果果皮所含色素的主要种类有花青苷、叶绿素及类胡萝卜素等，色泽表现由各种色素之间的比例和含量决定。未成熟的苹果果皮中所含色素主要为叶绿素，因而一般表现绿色。随着果实的成熟，果皮中的叶绿素不断降解，绿色逐渐消失；同时因花青苷、胡萝卜素等的含量和比重逐渐增加，果皮呈现出红色或黄色等不同的色泽。果皮色素中花青苷占比较大的苹果呈红色，果皮色素中胡萝卜素和叶黄素占比较大的苹果则呈黄色[7]。
1.2.2 苹果的色泽评价
1.2.2.1 色泽评价标准
目前国外主要有以下 4 种苹果描述标准：
（1）国际植物遗传资源研究所（IPGRI）联合欧洲各国、美国农业部等多个部门在 1982 年出版的苹果描述符（Apple Descriptors，简称 AD），其中有 42 个基础数据描述符、11 个初评数据描述符和 63 个再评数据描述符。
（2）国际植物新品种保护组织（UPOV）针对苹果新品种、苹果砧木和观赏苹果分别制定的苹果特异性、一致性和稳定性测试指南。苹果新品种测试指南（简称ADUS）中共有 57 个描述符；苹果砧木测试标准（简称 ARDUS）有 32 个描述符；观赏苹果测试指南（简称 OADUS）有 38 个描述符。三者互为依据，因此实际测试中可同时参考 3 个指南。
（3）日本农业生物资源研究所在 1999 年制定的植物资源性状鉴定标准，其中将苹果描述符（简称 JD）分成 3 类，分别为主要性状描述符 12 个，次要性状描述符27 个和第 3 性状描述符 15 个。
2 ‘富士’果皮 lncRNA 测序与分析
2.1 材料和方法
2.1.1 试验材料
试验材料取自烟台市农业科学研究院苹果品种资源圃，挑选生长发育良好的 14年生‘富士’苹果树 6 棵，其中片红果实树 3 棵，条红果实树 3 棵。根据本实验室前期着色变化剧烈期的结果，于摘袋后第 6 天取‘富士’苹果果皮（约 1 mm），按照不同着色类型分为两组，片红‘富士’（BRT）和条红‘富士’（SRT）。每组又分为 3 个重复，BRT1、BRT2、BRT3 和 SRT1、SRT2、SRT3。
2.1.2 构建测序文库
将两组（BRT 和 SRT）果皮组织样品送到广州基迪奥生物科技有限公司进行lncR NA 测序。样品提取总 RNA 后，去除其中的核糖体 RNA，以最大限度保留所有codingRNA 和 ncRNA。将得到的 RNA 随机打断成为短片段，再以片段化后的 RNA为模板，用六碱基随机引物（random hexamers）合成 cD NA 第一链；接着加入缓冲液、dNTPs、RNase H 和 DNA polymerase I 合成 cD NA 第二链；经 QiaQuick PCR 试剂盒纯化后，加入 EB 缓冲液洗脱末端修复、加碱基 A，加测序接头，然后通过 UNG（Uracil-N-Glycosylase）酶降解第二条链。用琼脂糖凝胶电泳进行片段大小选择，进行 PCR 扩增。最后建好的测序文库用 Ilumina HiS eqTM 4000 进行测序（图 2-1）。
2.2 结果与分析
2.2.1 测序数据与转录本统计
2.2.1.1 测序数据过滤分析
过滤后 6 个样本中数据质量达到 Q20（即测序准确率为 99 %）的碱基数目由过滤前的 97.9 %提升到 98.7 %以上，N 碱基的数目均低于 0.00 %（表 2-1）。在 BRT 和SRT 两组共 6 个果皮样本中分别得到 92063044、81197270、97793890、85594062、89731848、90923348 条序列，将含有接头的 reads、全部都是 A 碱基的 reads、含 N比例大于 10 %的 reads 和低质量的 reads 去除，留下的高质量序列（HQ Clean Reads）比例均在 97.7 %以上（表 2-2）。
3 不同色相‘富士’苹果解袋后的着色差异.....................................25
3.1 材料与方法 .....................................25
3.1.1 试验材料和处理 ......................................25
3.1.2 主要仪器和试剂 .........................................25
4 lncRNA 及靶基因在不同苹果品种中的表达 ............................37
4.1 材料与方法 ............................37
4.1.1 试验材料 .....................................37
4.1.2 试验方法 ..................................37
5 结论与展望 ................................45
5.1 结论 ........................45
5.2 展望 ..........................46
4 lncRNA 及靶基因在不同苹果品种中的表达
4.1 材料与方法
4.1.1 试验材料
本研究所用的‘美国 8 号’、‘信浓红’、‘粉红女士’、‘皮诺娃’、‘华硕’等 22个红色苹果品种及‘印度青’、‘金帅’、‘青香蕉’、‘金富’、‘瑞雪’等 11 个非红色苹果品种，均于 2019 年采自烟台农业科学院苹果品种资源圃。针对不同苹果品种设置了不同的采样时间，具体采样时间见表 4-1。试验设置 3 次生物学重复，挑选生长发育良好的不同品种苹果树各 3 棵，在每棵树上随机选取 5 个果实作为一次重复，每次采样均于上午 8:00～10:00 进行。将同一重复组的果实刮取约 1 mm 厚的果皮，混合为一个样品，进行液氮速冻后于-80 ℃保存备用。
4.1.2 试验方法
4.1.2.1 植物总 RNA 提取与 cD NA 第一链合成
使用 TIANGEN 多糖多酚植物总 RNA 提取试剂盒（DP441）提取 33 个苹果品种果皮的总 RNA，具体操作步骤参照说明书。使用 TIANGEN FastKing RT Kit（With gD Nase）进行反转录，合成 cD NA 第一链，具体操作步骤参照说明书。
5 结论与展望
5.1 结论
（1）对不同色相‘富士’果皮进行高通量测序，共得到 46 个显著差异表达的lncR NA，其中 15 个可能作为 miR NA 前体。预测到 21 个 cis 作用靶基因、34 个 tra ns作用靶基因，靶基因主要参与代谢过程、细胞过程、类黄酮生物合成、光合作用-天线蛋白等。TCONS_00045933 在片红‘富士’中表达量高，在条红‘富士’中表达量低，预测其 trans 作用靶基因为 bHLH36，与花青苷合成有关。由
