【摘要】口腔医学论文帮写目的:观察LPS对人牙髓成纤维细胞(HDPF)表达基质金属蛋白酶抑制剂1,2(TIMP-1,2)的影响。方法:体外培养HDPF,用1、10、100μg/mL LPS分别刺激2 d,采用免疫组化和图像分析法,观察HDPF表达TIMP-1,2的变化。结果:不同质量浓度的LPS对TIMP-1,2的影响不同。与空白组相比,10μg/mL的LPS刺激HDPFTIMP-1的表达明显增加(P<0.01);LPS质量浓度为100μg/mL时,HDPF表达TIMP-1明显减弱(P<0.01)。LPS对TIMP-2的影响呈浓度依赖关系;LPS质量浓度≥10μg/mL时,TIMP-2表达显著减弱(P<0.01)。结论:LPS通过改变牙髓成纤维细胞TIMP-1,2的表达量,影响炎症过程。
【关键词】基质金属蛋白酶抑制剂-1,2;免疫组织化学;人牙髓成纤维细胞；LPS
基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)是一组依赖二价金属阳离子的内肽酶,对细胞外基质(extracellular matrix,ECM)有特异的降解作用,它参与许多正常的生理和病理过程。基质金属蛋白酶抑制剂(tissue inhibitor of metallopro-teinases,TIMPs)是MMPs的拮抗剂,能有效地抑制MMPs对ECM的作用[1]。LPS作为牙髓、尖周病的主要致病因子,对牙髓细胞表达TIMP-1,2有无关系目前报道较少。本研究利用免疫组化和图像分析技术,探讨不同浓度的LPS对体外培养人牙髓成纤维细胞TIMP-1,2表达的影响。
1 材料和方法
1.1 主要试剂
鼠抗人TIMP-1,2单克隆抗体(福建迈新公司);SABC免疫组化染色试剂盒(武汉博士德公司);大肠杆菌标准LPS(军事科学院五所)。
1.2 人牙髓细胞标本制备
取对数生长的第6代人牙髓成纤维细胞,2.5 g/L胰酶消化,加入含100 mL/L胎牛血清的DMEM培养液,制备细胞悬液。以5×104/mL细胞密度接种到预先放有盖玻片的培养皿中,37℃,50 mL/L CO2培养24 h后,换含有20 mL/L胎牛血清的DMEM培养液适应培养24 h,将LPS以1、10、100μg/mL的不同质量浓度加入培养液中,设空白对照组,继续培养2 d后取出盖玻片,以0.01 mol/LPBS洗3次,40 g/L多聚甲醛-磷酸盐缓冲液4℃固定1 h,备用。
1.3 免疫组化染色
按试剂盒说明书提供的步骤进行:固定好的细胞爬片,以30 mL/L过氧化氢液室温15 min以消除内源性过氧化物酶,微波抗原修复,正常山羊血清室温封闭30 min,滴加一抗,4℃过夜,37℃复温1 h;滴加1∶100稀释的生物素标记二抗,37℃30 min;1∶100稀释SABC,37℃30 min。以上每一步骤后用0.01 mol/L PBS缓冲液振洗3次,每次5 min。滴加新鲜配制的DAB显色液,镜下控制显色,脱水,透明,封片。阴性对照用PBS代替一抗。
1.4 图像分析
应用HPIAS-1000高清晰度彩色病理图像分析系统,将染色的细胞爬片在镜下统一放大3.3×40倍,每张爬片随机选取不相重叠的10个视野,每个视野选取2~4个细胞,用鼠标描绘所测细胞胞浆区域,计算机自动进行测量,获得每张爬片的平均灰度值(-x±s),并对4组数据进行统计分析。
2 结果
TIMP-1,2的染色阳性部位在细胞浆,呈棕黄色颗粒。TIMP-1,2在HDPF中均为阳性表达;1、10、100μg/mLLPS刺激的人牙髓成纤维细胞均有不同深浅的阳性表现(图1~4,见彩色插页)。
图像分析结果表明:LPS质量浓度为1μg/mL时,体外培养的HDPF表达TIMP-1,2无明显变化(P>0.05);为10μg/mL时,HDPF表达TIMP-1明显增强(P<0.01);为100μg/mL时,HDPF表达TIMP-1明显减弱。随LPS质量浓度的增加,HDPF表达TIMP-2呈减弱趋势。1和10μg/mL组TIMP-2表达差别显著(P<0.01);10和100μg/mL组TIMP - 2表达无明显改变(P>0.05)。
3 讨论
细胞外基质是由多种大分子形成的、高度组织化的网络结构,是正常细胞维持生存运动和分化的适宜环境。细胞外基质的合成与降解平衡保证了ECM的完整性,MMP在其中起重要作用。TIMPs是MMP活性的重要内源性调节因子,已报道了4个成员(TIMP-1~4)[2],它们以1∶1克分子比与MMP连接形成紧密的非共价复合物,从而抑制MMP的活性。炎症过程中TIMP和MMP的失衡导致组织的破坏。TIMP在体内广泛表达,TIMP-1,2在正常及炎症牙髓组织均有表达[3],提示它们参与了牙髓炎症反应。TIMP受多因素调节,维甲酸、细胞因子(TGF-β、IL-6、IL-11 )等可增加组织内TIMP水平。很多研究证明LPS影响多种细胞MMP和TIMP的表达[4,5]。本实验发现,1、10、100μg/mL质量浓度的LPS作用于HDPF,与对照组相比,表达的TIMP-1,2平均灰度值改变并不一致。表明LPS刺激后的HDPF表达TIMP-1,2有明显变化。10μg/mL的LPS可以使HDPF表达TIMP-1明显增强(P<0.01),而TIMP-2明显减弱(P<0.01);100μg/mL的LPS使HDPF表达TIMP-1和TIMP-2均明显减弱。即随着LPS质量浓度的增加,HDPF表达TIMP-2逐渐减弱;而对TIMP-1来说,表达量呈现先增加后减少的趋势。Pagenstecher等[6]研究发现,LPS引起的内毒素血症小鼠TIMP-1在肝、脾、肾表达上调,同时诱导脑组织TIMP-1的表达。Yao等[7]研究发现LPS、IL-1β对人支气管上皮TIMP-1的表达无影响,而TNF-α降低其转录。说明LPS对TIMP-1的影响因组织细胞类型的不同而异,LPS通过改变牙髓细胞TIMP-1,2的表达量,而影响牙髓炎症过程。
炎症因子可以刺激培养的人牙髓细胞产生MMP。MMP可能降解前期牙本质,阻止其矿化。在炎症过程中,MMP-1,2对结缔组织的破坏起着重要的调节作用[8],而TIMP-1可与活化的MMP-1形成稳定的复合物,从而抑制MMP-1的活性。有研究证明,胶原-磷酸钙凝胶、天然强化胶原溶液作为盖髓剂用于盖髓术均可诱导牙本质桥的形成。本研究结果表明,10μg/mL的LPS短期(2 d)刺激HDPF,其TIMP-1的表达明显增加(P<0.01),说明较弱的刺激可以激发牙髓组织的自身修复潜能,通过增加TIMP-1的量来抑制MMP的活性,而防止其对组织的破坏。牙髓组织自身的修复能力是有限的,随着刺激的加强,TIMP的表达减少,MMP与TIMP之间的平衡被打破,组织的降解强于自身修复,炎症过程加剧。同时,在炎症初期,通过增加外源性TIMP抑制MMP的活性来增强牙髓组织的自身修复,可以成为临床治疗的新思路。
LPS是位于G-菌细胞壁上的一种多聚糖聚合的多糖体和类脂构成的大分子化合物,生物学效应极其复杂。在低浓度下可以促进HDPF分裂和基质合成,而在高浓度下对HDPF具有明显的细胞毒性作用,引起细胞死亡。TIMP-1是一类多功能的蛋白,对多种细胞具有类似生长因子的作用[9],它可以通过不同途径影响细胞功能。本实验中10μg/mL的LPS短期刺激HDPF,其TIMP-1的表达明显增加(P<0.01)的结果是否与TIMP-1参与细胞生长有关尚待证明。
【参考文献】
[1]林媛,吴补领.牙齿发育中的基质金属蛋白酶[J].牙体牙髓牙周病学杂志,2000,10(6):355
[2] http://www.51lunwen.org/kouqiang/Gomez DE,Aloneo DF,Yoshiji H,et al.Tissue inhibitors of metallo-proteinases: structure, regulation and biological functions[J].EurJCell Biol,1997,74(2):111
[3]林媛,吴补领,余擎,等.基质金属蛋白酶抑制剂-1、-2在人牙髓组织和细胞中表达的免疫组化研究[J].临床口腔医学杂志,2001,17(2):93
[4] Gottschall PE, Yu X.Cytokines regulate gelatinase A and B (matrixmetalloproteinase 2 and 9) activity in cultured rat astrocytes[J].JNeurooncol,1995, 64(4):1513
[5] Scheller M, http://www.51lunwen.org/kouqiang/Zimmermann B, Bernimoulin JP,et al.Induction ofmetalloproteinase activity, cartilage matrix degradation and inhibi-tion of endochondral mineralizationin vitroby E. coli lipopolysac-charide is mediated by interleukin 1 alpha[J].Cytoki
