浅析纤维调节素在大鼠正常牙周组织中的免疫化学定位和表现

浅析纤维调节素在大鼠正常牙周组织中的免疫化学定位和表现

【摘要】　目的研究纤维调节素(fibromodulin)帮写医学论文在正常牙周组织中的分布和表现,以明确纤维调节素在牙周组织自身稳定中的作用。方法　用免疫组织化学和逆转录-聚合酶链反应技术,对正常Lewis鼠磨牙牙周组织的纤维调节素及相关蛋白多糖和胶原的组织分布和牙周细胞的mRNA表现进行分析。结果　纤维调节素在靠近口腔牙龈面的区域和牙周韧带-牙槽骨、牙周韧带-牙骨质界面有强阳性表现;核心蛋白聚糖强阳性表现于牙龈组织龈沟附近的区域;双糖链蛋白聚糖则在牙龈上皮着色明显。从mRNA的表现可以看出,纤维调节素,核心蛋白聚糖和双糖链蛋白聚糖在成骨细胞中强烈表现,其蛋白密度是其他两种细胞的1~3倍;Ⅰ型、Ⅲ型胶原的mRNA在牙龈成纤维细胞中表现水平较高,其蛋白密度是其他两种细胞的1·5倍以上。结论　纤维调节素可能与其他小蛋白多糖相互作用,调节胶原纤维的网络形成,并可能参与牙槽骨和牙骨质矿化。

【关键词】　胶原;　牙周组织;　免疫组织化学

蛋白多糖是一组普遍存在于连接组织中的大分子糖蛋白,它们作为基质结构的组成成分定位于基质内,以及细胞表面和细胞器内[1]。纤维调节素(fibromodulin)是细胞外基质富含亮氨酸的蛋白多糖家族中的一员。牛的纤维调节素的氨基酸序列显示与同家族的蛋白多糖核心蛋白聚糖(decorin)和双糖链蛋白聚糖(biglycan)非常相似[2]。已经有充分证据说明,纤维调节素在胶原纤维上有规律地分布,参与胶原纤维网络形成的调节,并能与Ⅰ型、Ⅱ型等胶原相互作用[3]。纤维调节素也能与转化生长因子-β(transforming growth factor beta,TGF-β)相互作用,在基质内调节该生长因子[4]。

牙周组织因其咀嚼功能而重塑自己。与其他活组织一样,牙周组织中的成分处于经常活动的状态,细胞代谢、再生、死亡和被取代;非细胞成分,如胶原和细胞外基质的其他成分也同样经历着被合成、分解和取代的过程。在健康状态下,这个过程被精确控制,并维持平衡。既然纤维调节素与胶原纤维的网络形成有关,可以假设纤维调节素与胶原更替有密切关系,参与牙周组织的自身稳定。鉴于国际上未见纤维调节素在牙周组织中系统分布的文献报道,此文试图揭示纤维调节素在正常牙周组织中的分布和它的细胞表现,以及与胶原(Ⅰ型和Ⅲ型)和其他小蛋白多糖(biglycan和decorin)的关系。

材料和方法

1.动物和组织预备:5只正常雄性Lewis大鼠用于纤维调节素的研究。鼠龄12周,体重230~260g。过量注射苯巴比妥钠(10 mg/100 g)处死大鼠,分离下颌第一磨牙及其周围的牙槽骨、覆盖的牙龈组织。组织块经4%多聚甲醛固定,10% EDTA脱钙,常规脱水,包埋,切片。HE染色显示组织学表现。

2.免疫组织化学染色:按以前描述过的方法对组织切片进行免疫组织化学染色[5]。抗纤维调节素抗体由美国Tampa大学AHK Plass教授赠送,1∶2 000稀释;抗biglycan ,抗decorin ,抗Ⅰ型胶原,抗Ⅲ型胶原抗体,均由美国Maryland国家卫生研究院LWFisher教授赠送,分别为1∶2 000,1∶3 000,1∶7 500,1∶4000稀释。对照组中,PBS取代一抗。

3.细胞培养:人类牙龈成纤维细胞,牙周韧带成纤维细胞和成骨细胞取自澳大利亚昆士兰大学牙学院研究实验室。将细胞培养在DMEM培养基中[6,7],并加入胎牛血清,青霉素,链霉素以及非必需氨基酸。实验所用细胞为第四到第八代。

4.逆转录酶-聚合酶链反应(RT-PCR):按以前描述过的方法从培养的细胞中提取总RNA,运行RT-PCR程序,所得产物在2%琼脂糖凝胶中电泳[8],用NIH1·57软件对电泳结果进行密度测定。选用的引物序列为:纤维调节素5′-AGCCTCATCGAGATCTGA-3′和5′-GGAGTGGGT-GAAGTGGA-3′,微球蛋白5′-CCCCCACTGAAA-AAGATGAG-3′和5′-TCATCCAATCCAAATGCGGC-3′, decorin5′-GATCACCAAAGTGCGAA-3′和5′-CCAGAGAGCCATTGTCA-3′, biglycan 5′-TGGAGA-ACAGTGGCTTTGAAC-3′和5′-TTCTCGATCATC-CTGATCTGG-3′,Ⅰ型胶原5′-GTGGGC-TTCCTGGTGA-3′和5′-CTTTGGAGCCAGCTGGA-3′,Ⅲ型胶原5′-GGTACTCCTGGTCTGCA-3′和5′-GAAGCC-AGCAGCACCA-3′。这些引物的PCR循环次数,变性温度退火温度,延长温度和时间为:纤维调节素和decorin,33次,94℃1min,50℃30 s,72℃1 min;微球蛋白33次,94℃1 min,60℃30s,72℃1min;biglycan 35次,94℃1min,55℃2min,72℃3min;Ⅰ型胶原α2和Ⅲ型胶原α1,31次,94℃1min,55℃2min,72℃3min。

结果

1.在牙龈组织中的分布:纤维调节素在牙龈上皮和牙龈连接组织有特别的分布(表1)。在牙龈上皮的口腔面,基底上层角质形成细胞对纤维调节素中度着色。树突状细胞也有明显的阳性着色。与之对比,龈沟上皮和结合上皮的鳞状角质形成细胞层和非角质形成细胞着色较弱。而在基底细胞层,基底角质形成细胞和基底细胞膜无纤维调节素阳性表现。Ⅲ型胶原在牙龈上皮的分布与纤维调节素类似。biglycan也有类似表现,但它在牙龈上皮表现更强。decorin却不同,它在牙龈上皮基底膜区着色浓密。Ⅰ型胶原在牙龈上皮表现较弱。在牙龈连接组织,牙龈成纤维细胞和牙龈连接组织基质对纤维调节素有很强的着色。纤维调节素在牙龈上皮下方靠近口腔面的区域,着色明显强于靠近牙面的区域。Ⅰ型胶原在牙龈连接组织中的分布与纤维调节素相似。与Ⅰ型胶原比较,Ⅲ型胶原在牙龈连接组织中数量较少。其他两种蛋白多糖在牙龈组织中显示与纤维调节素不同的细胞和基质分布形式: decorin和biglycan表现为细胞内分布;biglycan着色细胞的比例高于decorin,但decorin着色浓度高于biglycan。

2.在牙周支持组织中的分布:纤维调节素在牙周组织中的分布见表2。在牙周组织内,特别是邻近牙骨质和骨表面的区域,纤维调节素在牙周韧带成纤维细胞中表现明显。牙周韧带基质也显示中度阳性着色。纤维调节素的强烈表现主要位于沿着牙槽嵴和固有牙槽骨的内表面排列的成骨细胞。骨细胞和类骨未见明显的着色。沿着根面,纤维调节素在成牙骨质细胞、牙骨质细胞和类牙骨质中表现阴性。非细胞层牙骨质也未见纤维调节素阳性着色。与纤维调节素比较,I型胶原在牙槽骨基质中着色很强。Ⅲ型胶原在牙周组织中的表现弱于I型胶原。decorin和biglycan在牙周组织中没有显示特别的分布。

3.RT-PCR结果分析成骨细胞,牙龈成纤维细胞和牙周韧带成纤维细胞中提取的RNA,在1%琼脂糖凝胶中电泳,得到两条带,分别为28S和18S。RT-PCR产物在2%凝胶中电泳,显示纤维调节素、decorin、biglycan、Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原和微球蛋白在三种细胞中的mRNA表现(图1A)。这些蛋白分子的mRNA水平通过凝胶密度分析程序来定量。微球蛋白mRNA水平作为参照值。密度分析结果(图1B)显示,纤维调节素的mRNA在成骨细胞中水平较高,在牙龈成纤维细胞和牙周韧带成纤维细胞中则较低。decorin和biglycan mRNA表现与纤维调节素近似。Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原的mRNA水平则在牙龈成纤维细胞高于成骨细胞和牙周韧带成纤维细胞。

讨论

此研究显示,纤维调节素在插入牙槽骨和牙骨质的牙周胶原纤维中有很强的表现,但在这些部位矿化的胶原纤维中表现阴性。既然与I型胶原相关的蛋白多糖可能抑制软连接组织的矿化,纤维调节素就有可能在牙槽骨-牙周韧带和牙骨质-牙周韧带软硬组织交界处的附着纤维的早期形成中起调节作用。以前的研究表明,纤维调节素在牛的前期牙骨质和牙骨质细胞周区域有特别的组织分布,可能调节牙骨质矿化[9]。然而,在人类牙骨质中未见纤维调节素的表现[10]。此研究在大鼠模型中也不能观察到细胞层和非细胞层牙骨质的纤维调节素免疫阳性表现。这种差异性表现反映了种系之间的不同。

据体内体外实验观察,纤维调节素表现于成骨细胞中,提示纤维调节素可能与骨形成有关。骨骼中的成骨细胞可以合成细胞外基质,而后者是维持骨骼组织正常结构和功能的关键[11];非胶原蛋白与胶原和其他基质蛋白相互作用,维持骨骼的完整[12]。据报道,纤维调节素在软骨和骨细胞中的进展性表现,可能在软骨内和膜间骨形成中起作用[13]。在此研究中,decorin和biglycan mRNA也有与纤维调节素类似的表现形式,在成骨细胞中表达丰富。富含亮氨酸的小蛋白多糖家族中的几个成员能在骨骼基质构建中互相替代,在维持骨组织自身稳定中起作用。

纤维调节素是粘结胶原的蛋白多糖,其着色区位于I型胶原着色区内。纤维调节素强着色于连接牙槽骨和牙骨质的胶原纤维,提示它可能与胶原相互作用,影响软硬组织界面的胶原纤维生成[3,14]。纤维调节素通过核心蛋白粘结胶原,控制胶原纤维直径和纤维间间隙,从而影响胶原纤维生成;若去除纤维调节素,所有的胶原纤维束排列紊乱,形态异常[15]。纤维调节素对胶原纤维的粘结特征,提示纤维调节素可能在牙周组织的发育和再生中起作用。

以前的研究揭示,decorin在体外实验中能粘结胶原纤维,抑制胶原纤维生成[