简析蚕蛹水溶性蛋白的氨基酸组成的结构和特性的研究方法

简析蚕蛹水溶性蛋白的氨基酸组成的结构和特性的研究方法

导读：依据蚕蛹水溶性蛋白的氨基酸组成的结构和特性，硕士毕业论文范文本文就如何更好的对其应用范文的提高和开发价值的提升进行论述。

1材料与方法

1.1材料与试剂

生工生物工程（上海）有限公司；其余试剂均为国产分析纯。

1.2仪器与设备PHS-2F型pH计：上海精密科学仪器有限公司；LR10-24A型离心机：北京雷勃尔有限公司；DHG-9204A型电热恒温鼓风干燥箱：上海一恒科技有限公司；SSY-H型恒温水浴锅：上海三申医疗器械有限公司；MOS-450圆二色谱仪：法国Biologic公司；Agilent1100液相色谱：美国安捷伦公司；FJ-200高速分散均质机：上海标本模型厂。

1.3方法

1.3.1蚕蛹水溶性蛋白的提取取10 g蚕蛹粉，加入100 mL蒸馏水，在20 000 r/min下均质10 min，然后再室温搅拌1 h，在5 000 r/min离心5 min，取出上清液，缓慢加入硫酸铵进行盐析沉淀（饱和度为60％），10 000 r/min离心10 min，收集沉淀，将沉淀透析48 h，然后冷冻干燥备用。

1.3.2氨基酸组成分析采用RP-HPLC（Agilent 1100）在338 nm检测波长下测定蚕蛹蛋白的氨基酸组成，处理好的样品采用OPA柱前自动衍生。样品处理方法：将1 g样品溶于6μmol/L HC（l6 mL）中，水解管密封后，在110℃中水解24 h；测定色氨酸时样品处理方法为：将1 g样品溶于4 mol/L NaOH（6 mL），在110℃水解20 h。

1.3.3氨基酸的评分根据FAO/WHO 1993年建议的每克氨基酸评分标准模式进行营养价值评定，该模式中，苏氨酸、缬氨酸、蛋氨酸+胱氨酸、苯丙氨酸+酪氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸和色氨酸分别为：4.0、5.0、3.5、6.0、4.0、7.0、5.5和1.0 g/100 g[4]。氨基酸评分按下式计算：

1.3.4蛋白质效率比（PER）根据Alsemeyer等[5]提出的方程计算蛋白质效率比，方程如下：

式中：PER为蛋白质效率比；HLeu为Leu在蛋白中的质量百分含量；HPro为Pro在蛋白中的质量百分含量；HTyr为Tyr在蛋白中的质量百分含量；HMet为Met在蛋白中的质量百分含量；HHis为His在蛋白中的质量百分含量。

1.3.5体外蛋白消化率（IVPD）测定蚕蛹蛋白的IVPD测定根据Bilgi觭li N.等[6]描述的方法。将含有6.25 mg/mL的蛋白样品溶液50 mL在5℃下搅拌60 min，使其蛋白充分混匀。然后将蛋白样品放置在37℃的水浴锅中，用0.1 mol/L NaOH或HCl调pH至8.0并一直搅拌。称取80 mg胰蛋白酶溶于50 mL蒸馏水中并保持在冰浴中，用0.1 mol/L NaOH或HCl调pH至8.0。取5 mL胰蛋白酶溶液加入准备好的样品溶液中，在37℃下一直搅拌。此时，样品溶液的pH开始下降，加酶15 s后开始计时，记录酶解10 min时的pH。根据下式计算蛋白消化率： 式中：Y为IVPD值，％；X为酶解10 min时的pH。

1.3.6蛋白质消化率校正的氨基酸记分法（PDCAAS）蛋白质消化率校正的氨基酸记分法（PDCAAS）的计算根据Grazziotin等[7]报道的方法。按下式计算PDCAAS：PDCAAS＝最小氨基酸评分分数×体外蛋白消化率/100

1.3.7圆二色谱分析测定条件：被测样品浓度为0.15 mg/L，样品池的光径为0.1 cm,在190 nm～250 nm范围内扫描，扫描速率100 nm/min，分辨率0.1 nm，响应时间1 s，累积次数3次。

1.3.8差示扫描量热仪（DSC）分析取10 mg的蚕蛹水溶性蛋白样品置于铝盒中压片，以空铝盒为空白对照，氮气流速20 mL/min，扫描范围为20℃～120℃，升温速率为10℃/min。

2结果与分析

2.1蚕蛹水溶性蛋白的氨基酸组成分析蚕蛹水溶性蛋白的氨基酸组成分析见表1。从表1可以看出，蚕蛹水溶性蛋白中，谷氨酸含量最高（18.32 g/100 g）。谷氨酸在人体内主要以谷氨酰胺的形式存在，是细胞增殖生长必不可少的物质，能够为嘌呤和嘧啶的合成提供充足的氮源[8]。蚕蛹水溶性蛋白的必需氨基酸模式完全符合成人的FAO/WHO推荐模式，且基本符合小孩的FAO/WHO推荐模式（亮氨酸低于模式值）[9]。蚕蛹水溶性蛋白中含有丰富的赖氨酸（6.87g/100g），高于其在亨氏马尾藻蛋白（4.5g/100g）[10]、大豆蛋白（5.5 g/100 g）[11]和大米蛋白（4.0 g/100 g）[11]中的含量。以谷类为主要膳食的小孩更容易缺乏赖氨酸，

由于赖氨酸能够促进大脑发育，是肝及胆的组成成分，能促进脂肪代谢，调节松果腺、乳腺、黄体及卵巢，防止细胞退化[8]。因此，充足的赖氨酸摄入是幼儿生长发育的重要保障。此外，组氨酸对幼儿生长发育也极为重要，它能促进幼儿的免疫系统功能尽早完善以及强化生理性代谢机能等，在蚕蛹水溶性蛋白中，组氨酸含量较高（8.36 g/100 g），显著高于其在亨氏马尾藻蛋白（1.2 g/100 g）[10]和鲳鱼蛋白（2.0 g/100 g）[8]中含量。因此，通过氨基酸组成分析可以看出，蚕蛹水溶性蛋白质是一种营养价值较高的蛋白资源。氨基酸根据其化学性质的不同可分为非极性氨基酸、极性中性氨基酸、酸性氨基酸、碱性氨基酸、含硫氨基酸和芳香族氨基酸。蚕蛹水溶性蛋白的氨基酸分

类见表2。从表2可以看出，非极性氨基酸在蚕蛹水溶性蛋白中含量最高，为总蛋白的39.42％，其次为酸性氨基酸，含硫氨基酸含量最低，占总蛋白的8.86％。尽管含硫氨基酸在蚕蛹水溶性蛋白中含量低，但远远高于它在脱脂小麦胚芽（2.41 g/100 g）[12]中的含量。芳香族氨基酸含量为10.88 g/100 g，明显高于其在脱脂小麦胚芽（7.6 g/100 g）[12]中的含量。研究表明，非极性氨基酸和芳香族氨基酸对多肽的生物活性有重要影响。当非极性氨基酸和芳香族氨基酸出现在多肽的C端时，该肽具有较强的体外降血压和抗氧化活性[13-14]。由此可以看出，蚕蛹水溶性蛋白或许能够被用于制备生物活性肽。

2.2蚕蛹水溶性蛋白的营养评价蛋白中的氨基酸含量特别是必需氨基酸含量是蛋白质质量的重要指标，WHO/UN（1973）建议，毕业论文范文高质量的蛋白质其必需氨基酸与总氨基酸的比值（E/T）在36％以上。蚕蛹水溶性蛋白的营养评价见表3。

从表3可以看出，蚕蛹水溶性蛋白的E/T为41.2％，远远高于WHO/UN建议模式。尽管蚕蛹水溶性蛋白具有较高的E/T值，然而与WHO/FAO的建议模式[4]相比有欠佳的氨基酸，由于氨基酸的生物效价主要与必需氨基酸的组成是否均衡有关。因此，这些氨基酸的不足引起了蚕蛹水溶性蛋白的营养价值降低。蚕蛹水溶性蛋白的第一、第二、第三和第四限制性氨基酸分别是亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸和苏氨酸，其它氨基酸的含量均高于同种氨基酸的理想含量（WHO/FAO建议模式）。其氨基酸评分为54.1，与甜荞麦蛋白的氨基酸评分（58）[15]基本接近。预测蛋白质效率比（PER）常作为蛋白质吸收利用的评价指标，PER越大其吸收利用越高。通常认为蛋白的PER大于2.0时，表明该蛋白具有较高的营养价值[16]。蚕蛹水溶性蛋白的PER1、PER2和PER3均明显小于2.0，这说明蚕蛹水溶性蛋白的氨基酸组成及其不平衡，特别是亮氨酸含量太低，引起它的PER小，最终导致氨基酸利用效率低。如果在蚕蛹水溶性蛋白中添加适量的亮氨酸，可以极大的提高它的PER值。蚕蛹水溶性蛋白具有较高的体外消化率（83.2%），这说明蚕蛹水溶性蛋白被人体摄入后，能够有效被肠道酶消化。蚕蛹水溶性蛋白的PDCAAS仅为0.45，略高于麦胚醇溶蛋白的PDCAAS（0.31）[13]，接近于麦胚球蛋白的PDCAAS（0.48）[13]，这说明蚕蛹水溶性蛋白并不能被作为高质量的蛋白使用。如果补充蚕蛹水溶性蛋白中限制性氨基酸含量或者作为蛋白补充添加剂加入其它蛋白原料中，将会极大的提高蛋白的生物效价。

2.3蚕蛹水溶性蛋白的二级结构分析蛋白质的α螺旋、β折叠、β转角和无规卷曲等二级结构可以通过CD数据反映出来，一般天然蛋白质的CD光谱含有一个正峰（在190 nm波长左右）和一个负槽（在205 nm～235 nm波长范围），其中，负槽的形状与主链构象密切相关。α-螺旋结构在靠近192 nm有一正的β谱带，在222 nm和208 nm处表现出两个负的特征肩峰谱带；β折叠的CD谱在216 nm有一负谱带，在185 nm～200 nm有一正谱带；β转角在206 nm附近有一正CD谱带[17]。蚕蛹水溶性蛋白的圆二色谱图见图1。

从图1可以看出，蚕蛹水溶性蛋白具有4种二级结构形式，分别为α-螺旋、β-折叠、β-转角和无规则状态。利用DICHROWEB Selcon 3软件对实验结果进行处理，得到α-螺旋、β-折叠、β-转角和无规则状态的含量分别为：20.9％、24.1％、19.2％和36.4％（表4），无规则状态的含量最高，这说明蚕蛹水溶性蛋白结构比较松散。

2.4蚕蛹水溶性蛋白的差示扫描量热仪分析蛋白质受热容易发生变性，使其肽链展开，破坏其高级结构，最终导致蛋白质各种食品功能特性明显降低或丧失[18]。因此，热变性是影响蛋白质在食品加工的

一个重要因素。目前，蛋白热变性温度的测定主要采用差示扫描量热仪进行测定。蚕蛹水溶性蛋白的差示扫描量热仪分析见图2。

从图2可以看出，蚕蛹水溶性蛋白共发生了2次热变性，这说明它可能存在2个主要的