本文是一篇药学论文，本文以分离纯化后的党参多糖 CPC 为实验材料，研究了其对 RAW264.7 巨噬细胞的免疫活性调节。结果表明，CPC 在 250~1000 μg/mL 浓度范围内不仅能促进巨噬细胞的增殖能力和吞噬活性，还能促进 NO、ROS 的释放以及 iNOS、TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-10 的分泌和基因表达。本文结果提示党参多糖 CPC 对巨噬细胞具有良好的免疫调节作用，有望成为潜在的免疫调节剂，为党参多糖的开发与利用奠定基础。
第一部分 党参多糖 CPC 的分离纯化和结构鉴定
1 材料、仪器与试剂
1.1 材料
党参药材于 2018 年 8 月购自山西省长治市平顺县党参种植基地，经山西医科大学药学院高建平教授鉴定为桔梗科（Campanulaceae）植物党参 Codonopsis pilosula（Franch.）Nannf.的干燥根，样品（样品编号 2018-08-MCM01）现保存于山西医科大学药学院中药教研室。
1.2 实验试剂及耗材
表 1-2 实验试剂及耗材
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2 实验方法
2.1 党参总多糖的提取
称取党参药材 20 kg，洗净，阴干，将其粉碎后用 10 倍量的甲醇（10:1，v/w）在室温下以 100 KHz 超声提取两次，每次提取 1 h。甲醇超声提取完毕后，滤过后将其晾干，过筛，得到党参粉末 10 kg。然后参照文献所报道的水提醇沉的方法进行党参多糖的提取[29, 30]。具体方法如下：取干燥后的党参粉末在料液比为 1：10 下加入蒸馏水于室温下浸泡过夜，在 100℃下加热回流提取三次，每次 1 h，用纱布滤过，收集并将三次滤液混合，得到党参多糖粗提液；离心（4000 r/min，15 min），将提取液旋转蒸发浓缩至 1/10 体积后，加 95%乙醇溶液至醇沉浓度为 80%，4℃冰箱静置 12 h；抽滤，将醇沉物分别用无水乙醇、丙酮、石油醚各洗 3 次，冷冻干燥得党参总多糖。提取流程图如图 2-1 所示：
图 2-1 党参总多糖提取流程图
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第二部分 党参多糖 CPC 对巨噬细胞的免疫调节活性研究
1 实验材料与仪器
1.1 实验材料
1.1.1 实验细胞株
小鼠单核巨噬细胞白血病细胞（RAW264.7）购于武汉普诺赛生命科技有限公司（货号 CL-0190）。
1.1.2 实验试剂及耗材
表 2-1 实验试剂及耗材
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2 实验方法
2.1 细胞培养
在 37℃，5 % CO2恒温条件下，将小鼠巨噬细胞株 RAW264.7 培养在含 10%胎牛血清(v/v)、1%青霉素(1×105 U/mL)和链霉素(1×105 μg/mL)的 DMEM 完全培养液中，每天定时更换培养液并观察细胞的生长状况，待细胞贴壁面积达到瓶底的 70%~80%进行传代。
2.2 实验分组与给药
根据实验需求，将处于对数生长期的细胞调整至适当密度，接种于细胞培养板中。待培养 24 h 后弃掉空白培养液，加入相同体积的空白培养液及含药培养液，具体分组情况见表 2-1。
表 2-1 细胞分组和处理方法
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第二部分 党参多糖 CPC 对巨噬细胞的免疫调节活性研究 ................................. 25
1 实验材料与仪器 ...................................... 26
1.1 实验材料........................................... 26
1.2 实验仪器设备.................................. 27
2 实验方法 ..................................... 28
2.1 细胞培养............................................. 28
2.2 实验分组与给药............................................... 28
2.3 CCK-8 法检测 RAW264.7 细胞的增殖活力 ............................. 28
4 讨论
巨噬细胞可以防御病原体和外来微生物的入侵，在调节促炎和抗炎细胞因子反应之间的平衡以及增强或减弱细胞免疫方面起着重要作用，因此巨噬细胞是免疫增强的重要组成部分[78]，其主要功能是吞噬和降解死亡细胞、细胞碎片和外来病原体，协调炎症过程[79]。在植物多糖的功效中，其刺激免疫系统发挥炎症反应的能力非常重要，因为它不仅增强了机体对病原体的天然免疫的防御机制，而且提供了补充治疗免疫受损疾病的有价值的手段[80]。研究表明，植物多糖通过刺激巨噬细胞而增强其吞噬能力，提高其释放 NO、ROS 等分子的水平以及增强细胞因子如 TNF-α、IL-6、IL-10、IL-1β、IFN-γ 等的分泌发挥着免疫调节活性。
本文以小鼠巨噬细胞为研究对象，采用 CCK 法研究 CPC 对细胞的毒性作用，从而探索 CPC 对小鼠巨噬细胞 RAW264.7 活力的影响，为进一步研究党参多糖CPC 的体外免疫活性提供基础。结果表明质量浓度为 250~1000 μg/mL 的 CPC 多糖溶液作用于巨噬细胞 24 h 后，能显著促进 RAW264.7 细胞的增殖，并且没有细胞毒性作用。
作为参与非特异免疫反应的免疫细胞，巨噬细胞具备良好的吞噬功能，其吞噬作用是机体防御异物入侵的主要机制之一[81]，因此巨噬细胞的吞噬能力是评价机体免疫强度的重要指标。本文以 RAW264.7 细胞为研究对象，评估了 CPC刺激后的巨噬细胞对中性红吞噬能力的影响。实验结果表明，CPC 能以剂量依赖性的方式显著提高巨噬细胞的吞噬能力，从而说明被 CPC 激活的巨噬细胞可以吞噬大量微生物和病原体，发挥着免疫调节作用。
活性氧（ROS）的产生主要来源于巨噬细胞，当微生物和病原体侵入机体时，巨噬细胞会分泌大量的 ROS 作为抵抗病原体的主要武器，因此 ROS 在先天免疫应答中扮演着关键角色[82]。本文中利用荧光倒置显微镜来检测 CPC 对 RAW264.7细胞中活性氧分泌的影响，结果表明，与空白对照组相比，CPC 能显著地刺激巨噬细胞 ROS 的产生，并且呈一定的剂量依赖性。
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5 结论
本文以分离纯化后的党参多糖 CPC 为实验材料，研究了其对 RAW264.7 巨噬细胞的免疫活性调节。结果表明，CPC 在 250~1000 μg/mL 浓度范围内不仅能促进巨噬细胞的增殖能力和吞噬活性，还能促进 NO、ROS 的释放以及 iNOS、TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-10 的分泌和基因表达。本文结果提示党参多糖 CPC 对巨噬细胞具有良好的免疫调节作用，有望成为潜在的免疫调节剂，为党参多糖的开发与利用奠定基础。
参考文献（略）
