本文是一篇药学论文，本文通过对平卧菊三七多糖进行系统性的研究，发现了该植物多糖成分具备免疫激活抗感染生物活性，今后可进一步进行开发及利用，有很大潜力开发成药用产品，促进了产业化及扩大了天然药物资源的利用；但本研究也存在不完整性，我认为可以在几个方面思考去进一步取得进展：第一在纯化工艺上，我们可以尝试利用更新的材料；第二在结构研究方面是不是可以减少一些传统的分析手段，运用更新技术做到简单快捷；第三在免疫激活及抗感染活性方面，是不是进一步进行动物试验验证后，抗感染免疫活性在体内体外的一致性更有利于我们更好的开发利用。
第一章 绪论
1.1 平卧菊三七研究概况
1.1.1 平卧菊三七资源介绍
平卧菊三七(Gynura procumbens (Lour) Merr.)，三七属也被称为蔓三七草。东南亚是其主要种植区，如马来西亚、印度尼西亚、泰国等；在中国，主要分布在南部，如广东、江西、海南等。作为一种传统的药用植物，具有生物活性和药理作用。国内外研究发现，对感冒、高血压、糖尿病等有较好的疗效[1][2]。平卧菊三七在 2012 年 5月被国家批准为新资源普通食品[3][4]。采用无性繁殖技术，在江西省宜春市、万载县、樟树等地大量栽培，产量高[5]。大量的栽培资源为其用于食品和医药行业的产业化奠定了基础，具有很大的发展潜力。
1.1.2 平卧菊三七化学成分研究概况
平卧菊三七具有一系列的作用功效，如抗炎、抗肿瘤、抗病毒等，之所以有这些生物活性，均源于其含有丰富的化学活性成分，如黄酮类、酚酸类等等，下面对其化学成分研究概况做一个简单的介绍。
1.1.2.1 黄酮类化合物化学研究
平卧菊三七含有黄酮类有效成分，黄酮类是中药的一类重要的化学成分，提取分离纯化检识是研究化学有效成分必不可少的一部分。目前对黄酮类成分提取分离纯化等方面的研究较为广泛。如 Kaewseejan 等[6]通过葡聚糖凝胶层析柱进行分离，选用型号为 SephadexLH-20，分离出两种黄酮类化合物分别是山奈酚及杨梅素。同时也利用反向高效液相色谱法从平卧菊三七叶子中分离得到了槲皮素。Akowuah 等[7]对平卧菊三七中的黄酮物质进行提取分离，采用有机溶剂萃取法，最后分别得到四种黄酮物质。在中药化合物的分离纯化过程中，我们可以根据要分离的目标化合物的化学性质及生物活性去找到合适的分离纯化方法，以便于更高效快速的获得我们想要提分的物质，能减少不必要的重复工作，有利于工作的推进。
..........................
1.2 多糖研究进展
1.2.1 多糖概述
多糖(polysaccharides, PS)通常又叫多聚糖, 是由 10 个及以上的单糖通过糖苷键连接形成的多羟基聚合物, 主要是从高等植物、藻类、菌类及动物体内进行提取得到。根据当前研究进展，将多糖分为植物多糖、细菌多糖、真菌多糖和动物多糖,是自然界含量最丰富的生物聚合物[28]。其中，植物多糖在自然界的资源及其种类十分丰富，并且分布广泛，具有多种生物活性与药理作用，如抗炎抗肿瘤等[28]。随着科学技术的快速发展，对植物多糖的研究也逐渐深入，从提取分离纯化到生物活性研究，为社会提供了更多的药物开发选择。平卧菊三七植物多糖的系统性研究未见报道。因此本文对平卧菊三七多糖成分进行提取分离纯化和结构鉴定的系统性研究，并进行相关体外细胞试验，让植物多糖自然资源得到开发和充分利用。下面将对植物多糖系统性研究的方法进行简要论述。
1.2.2 多糖提取方法研究
由于多糖的极性较大，因此易溶于水等极性较大的溶剂，如水等，不溶于极性小的有机溶剂。多糖的提取一般采用溶剂提取法。煎煮法最为常用，根据“相似相溶”原理，因水的极性较大，常常作为提取溶剂。例如枸杞多糖的提取[29]。该法具有简单可行、操作便捷、提取成本低等优点。同时，回流提取及连续回流提取法也常常应用到多糖的提取中，回流提取法实现了对温度的有效控制。此外，通过对多糖的理化性质及化学结构的进一步认识，引入了一些辅助提取方法，在传统的提取法基础上开发了一系列新的方法，如酸碱提取法、活性生物酶提取法、超声波辅助提取法、微波辅助提取法等[29]。
.............................
第二章 平卧菊三七多糖提取工艺研究
2.1 实验材料
2.1.1 实验原料
该植物药材原料种植于江西省宜春市植物种植基地，经江西农业大学廖为明教授鉴定其为平卧菊三七，并由江西省天然药物活性成分研究重点实验室主任邹一平教授购买，购入实验室后我们对植物进行相应处理，将药材进行去叶留茎秆，随后将其茎秆按照中药标准前处理步骤进行清洗切制等前处理工作，切制半径大小为 1 cm，经过前处理后的药材将其烘干并储藏于实验室干燥处，贴好标签待实验使用。
2.1.2 主要实验仪器及试剂
表 2-1 主要实验仪器及试剂
.......................
2.2 实验方法
为了使尽可能多的多糖成分从原材料中被提取出来，平卧菊三七茎秆提取采用热水回流提取加乙醇沉淀法，并采用 Sevag 法除蛋白，为后续进一步分离纯化、结构表征及生物活性研究提供原料基础。回流提取法已经在实践中使用很多年，工艺相对比较成熟，乙醇沉淀法在多糖的提取过程中也经常被使用，回流提取乙醇沉淀法提取率也较高，但因其不同植物多糖的差异性而使得得率具有差异性。本实验采用该法进行提取。多糖得率以葡萄糖作为标准品，采用苯酚-硫酸法测定，在 490 nm 处得到标准曲线方程 Y=0.0097X+0.0024,R2=0.9972，多糖含量采用葡萄糖标准曲线方程计算。多糖提取得率（mg/g）=粗多糖样品质量（mg）×多糖含量（%）/平卧菊三七质量(g)。采用单因素及响应面法对提取工艺进行优化，得到最佳提取工艺参数。
2.2.1 平卧菊三七多糖提取工艺流程
取茎秆前处理后的平卧菊三七药材茎杆 5 kg，加入提取罐中热水超声提取 4 h，并重复提取 2-3 次，每次得到的滤液均采用过棉花处理，合并几次得到的滤液，浓缩至一定体积；然后按照终浓度 75%计算所需乙醇量及蒸馏水量，进行醇沉 12 h-24 h左右，离心机离心弃上清留沉淀，用 Sevag 法去除沉淀蛋白，在透析袋中透析 24-36 h，然后用 75%-90%质量浓度的乙醇沉淀 12-24 h；将得到的沉淀在离心机 6000 r 下离心5-15 min，用 75%-90%质量浓度的乙醇洗涤三次再透析，然后将沉淀冻干后收集，即得粗多糖。
图 2-1 GPPS 多糖提取工艺流程
..........................
第三章 平卧菊三七多糖的分离纯化..........................23
3.1 实验主要材料设备及试剂...............................23
3.2 技术路线图.............................24
第四章 平卧菊三七多糖的化学结构表征............................28
4.1 实验主要材料及设备.......................28
4.2 技术路线图.............................29
第五章 GPPS-b 的体外细胞实验..........................35
5.1 实验主要材料及仪器...............................35
5.2 实验技术路线图............................35
第五章 平卧菊三七多糖体外细胞实验
5.1 实验主要材料及仪器
表 5-1 实验主要材料及仪器
..........................
第六章 结论与展望
6.1 结论
1.本研究采用超声辅助提取法对平卧菊三七多糖提取工艺参数进行优化，通过单因素及响应面试验，得到最佳工艺参数为料液比 25 mL/g，提取时间为 51 min，超声功率 74 Hz。在此条件下平卧菊三七多糖得率为 18.07%。
2.分别通过大孔树脂层析柱，阳、阴离子(Amberlite FPA90-Cl 和 FPC-3500)纤维素柱及 DEAE SepharoseF.F 凝胶柱色谱对平卧菊三七进行纯化,得到均一多糖GPPS-b，并计算出了 GPPS-b 的相对分子质量为 4886.68 Da。
3.对 GPPS-b 分别进行 GC 单糖组成分析，紫外光谱，傅里叶红外光谱，GC、GS-MS，扫描电镜等研究，推测出平卧菊三七均一多糖 GPPS-b 的单糖组成由葡萄糖、甘露糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖和鼠李糖，摩尔比为 48.6：20.0：15.7：9.7：3.3：2.6；紫外光谱图说明在 260-280 nm 处 GPPS-b 很少含核酸跟蛋白，与化学分析相一致；傅里叶红外光谱图表明存在吡喃糖环；GC-MS 研究得到结构是以吡喃糖环 Glc为主骨架构成，其主要结构由 Ara -(1→, →4)-Rhap-(1→, →4)-Xyl -(1→, Manp-(1→,Galp-(1→, →4)-Glcp-(1→, →6)-Glcp-(1→, →3)-Galp-(1→, →6)- Manp-(1→, →4,6)-Glcp-(1→组成；扫描电镜显示 GPPS-b 结构呈圆球棒状结构紧密，且表面相对光滑。
4.对 GPPS-b 进行体外细胞实验研究，发现平卧菊三七均一多糖 GPPS-b 具有抗感染免疫生物活性，通过 MTT 法，在 120 和 250 μg/mL 细胞存活率最大，进一步通过 NF-kB 及 IRF 免疫通路得出其免疫作用并呈现剂量相关。
参考文献（略）
