免疫学在兽医中侧重于免疫血清学诊断和免疫防治。在疾病的诊治中更是依靠免疫学诊断技术快速、准确地诊断出传染病病原和传播途径,对于传染病的预防控制尤为重要。免疫学检测即是根据抗原、抗体反应的原理,利用已知的抗原检测未知的抗体,或是利用已知的抗体检测未知的抗原。由于外源性和内源性抗原均可通过不同的抗原递呈途径诱导生物机体的免疫应答,在生物体内产生生物T细胞的克隆扩增和效应增强,并分泌特异性的免疫球蛋白—抗体。由于抗原抗体结合具有特异性和专一性的特点,这种检测可以定性、定位、定量地检测某一特异的抗原或抗体。病原体侵入动物体后,病原体的蛋白、核酸或是病原体本身都会成为抗原而引起机体的免疫应答。随着病原体的不同,机体免疫的应答也表现出不同的差异。通过检测病原体感染后产生的抗体或病原体本身的抗原就能达到检测疾病的目的。
血清凝集抑制试验、补体结合试验、免疫荧光抗体技术、酶联免疫吸附试验等血清学诊断技术均已广泛用于动物传染病、寄生虫病的诊断与监测,无论是灵敏度,抑或是特异性都有了极大的提高,仍是传染病诊断领域重要的检测手段之一。随着生物化学与分子生物学等学科,以及相关技术的飞速发展,免疫学研究亦已进入了分子水平时代,而且向其他许多学科渗透,已成为生命科学研究不可缺少的一门科学。目前在疾病诊断、控制技术的研究中,也不断取得新的进展,发展了许多新的检测技术。斑点ELISA、聚合酶链反应-ELISA、免疫转印技术、生物芯片技术,将各种生物技术结合起来,才能帮助我们及时、准确地诊断传染病,发现病原体,控制传播途径,并找到有效的治疗方案。
1 常规血清学诊断技术
1.1 血清凝集抑制试验(HI)
因为许多动物病毒能够凝集某种类动物的红细胞,由于血凝反应可被特异性抗体所抑制,抗体与病毒结合后,血凝素即不能吸附于红细胞表面的受体上。HI不象其它血清学试验,不需要种属特异的结合〔1,2〕,因此特异性不好。一般检测快速,用于大量筛选野生或饲养的动物样品中的抗体。
1.2 补体结合试验(CF)
由于一个抗体分子与抗原结合后,可以导致数百个补体分子的激活,呈现一定的放大作用,所以补体结合试验是一个比较敏感的方法。虽然在某些病毒型的鉴定上,补体结合试验的检测能力有时不及中和试验和血凝抑制试验,但补体结合试验稳定,特异性高,重复性好,一直仍用于动物血清学中特异性抗体的定量检测〔3〕。
1.3 免疫荧光抗体技术
通过显微镜标本的免疫荧光染色而显示其结果,由于病毒抗原的标记比较困难,常用标记抗体检查未知抗原,此技术具有抗原抗体反应的特异性和染色技术的快速性,并可以在细胞水平上进行抗原定位,故在病毒学研究和诊断中都是一种应用很广的方法〔4~7〕。另外,用此方法也可检测海洋微生物,尤其是细菌〔8〕,避免了细菌培养,从而提供了特异、快速的检测方法。
1.4 酶联免疫吸附试验(ELISA)
ELISA是应用最广的一项免疫学诊断技术,以物理方法将抗体(或抗原)吸附在固相载体上,随后的一系列免疫学和生物化学反应都在此固相载体上进行的免疫酶测定试验,无论是病毒病、禽传染性支气管炎抗体检测〔9〕、禽多瘤病毒特异性抗体检测〔10〕,还是细菌,例如牛布鲁氏杆菌病〔11,12〕,或是寄生虫引起的疾病、犬弓形体病〔13〕、羊肝片吸虫〔14〕,都应用到了酶联免疫吸附试验技术。因此,ELISA在各种动物疾病诊断上发挥了重要的作用。ELISA作为根除控制计划的初筛方法是非常理想的,费用相对较少,比常用的血清学方法有明显的优点,不需要抗体的第二特征,例如血凝性、结合补体的能力〔11〕,用时少,敏感性、重复性、特异性好,可筛选检测大量的样品〔15〕。利用纯化的抗原,单克隆抗体可提高反应检测的特异性〔9,10,11〕。
1.5 斑点酶联免疫吸附试验
将酶标反应板换成硝酸纤维膜,即为斑点酶联免疫吸附试验,将少量的试剂点在硝酸纤维膜或其它能结合蛋白的膜上,同抗原特异的抗体以及酶结合抗体反应,加入能形成不溶性有色沉淀的底物,使固相膜染色,形成有颜色的斑点,直接判读结果。利什曼原虫病〔16〕,牛呼吸道合包体病毒〔17〕,无钩绦虫〔18〕,免疫寄生虫〔19〕,克服了显微镜检查的麻烦。因硝酸纤维素膜吸附性能强,一般在包被后须再进行封闭。如将硝酸纤维素膜裁剪成膜条,并在同一张膜条上点有多种抗原,将整个膜条与同一份血清反应,则可同时获得对多种疾病的诊断结果,3种主要禽类疾病的同时检测〔20〕,多种蛋白的分析〔21〕,此方法快速,容易操作,已广泛应用于动物疾病的诊断。
免疫血清学技术的发展趋向一直是高度特异性、高度敏感性,精密的分辨能力,高水平的定位,试验电脑化,反应微量化,方法标准化和试剂商品化,以及方法简便、快速。随着生物化学和分子生物学等学科迅速发展,相继出现了许多新的诊断技术,可以从分子水平对疾病的致病机理,诊断、治疗和预防进行研究。
2 与分子生物学技术相结合的诊断技术
2.1 PCR-ELISA
将PCR技术与ELISA相结合的一种抗原检测技术,又称免疫PCR。该技术是由Sano T等在1992年建立的,其本质是一种以PCR技术代替酶反应来放大显示抗原抗体结合率的改进ELISA,利用ELISA技术检测PCR扩增的产物〔3〕。利用了PCR的指数扩增效率带来极高的敏感度,同时又具有高的特异性的抗原检测系统。用亲和素包被微孔板,封闭后,加入标记于捕获探针3’端的生物素,而捕获探针5’端和待检靶序列5’端的一段互补,通过生物素和亲和素的交联作用,将捕获探针固定在微孔板上,制成固相捕获系统。其次PCR缓冲液中加入一定比例的地高辛标记的DUTP,经PCR扩增后,扩增产物与微孔板上的捕获探针进行液相杂交,带有地高辛的靶序列即被捕获,再在微孔板中加入用辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗地高辛抗体,再加入底物如TMB显色,进行ELISA检测。
此法具有高灵敏度,检测结果可靠,可以进行半定量检测的优点,可用于病毒的检测、疾病诊断和目的基因检测。此方法较常规PCR灵敏度提高了10倍〔22,23〕,此方法鉴定PCR产物更快速,判定结果客观,易于操作,尤其在筛选大量品时,是非常理想、有用的工具。PCR-ELISA方法避免了在常规PCR中,由于非特异的产物和不名原因引起的条带反应,而作出的主观解释〔23〕。可筛选大量食源性病原体,帮助加工厂监测食品的污染水平,进行危险品分析〔24〕。尤其在寄生虫检测方面,以前多用血涂片,而现在应用PCR-ELISA检测牛巴贝虫〔25,26〕、布鲁氏锥虫〔27〕时,灵敏度可以提高1000倍,特异性强,至少较显微镜方法早一周检测出寄生虫。PCR-ELISA相对于凝胶光密度定量,在检定灵敏度、特异性、准确度上都有很大的提高〔28〕。
2.2 免疫印迹法(immunoblotting test,IBT)
亦称酶联免疫电转移印斑法(enzyme linked immunoelec-trotransfer blot,EITB),因与Southern早先建立的检测核酸的印迹方法Southernblot相类似,亦被称为Westernblot即蛋白质印迹,是一种将蛋白质凝胶电泳、膜电泳与抗原抗体反应相结合的新型免疫分析技术。蛋白质(病毒,细菌蛋白)经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE),根据相对分子质量大小分成区带,然后通过转移电泳将SDS-PAGE上的蛋白质转印到硝酸纤维素滤膜上。在转印膜上加上相应的标记抗体(如酶标抗体、胶体金标记抗体、荧光抗体、放射性同位素标记抗体),通过对结合抗体的标记物的检测,以分析特异性抗原蛋白区带〔29〕。免疫印迹依靠抗体的特异性检测小量样品,特别是检测pg级蛋白时,是非常有效的方法。本法综合了SDS-PAGE的高分辨力和ELISA法的高特异性和敏感性,是一个有效的分析手段,不仅广泛应用于分析抗原组分及其免疫活性,并可用于疾病的诊断。
2.3 免疫核酸探针技术
在核酸杂交中,为避免同位素探针半衰期短、操作不安全和废物难以处理的弊端,把免疫学方法引入核酸杂交技术,开拓了免疫核酸探针新技术,使分子杂交水平踏上了一个新的台阶。
在杂交过程中,作为探针的核酸与其互补的核酸形成RNA-DNA杂交体,此杂交体具有抗原性,因而可以用抗杂交体抗体,结合酶标记的抗抗体对杂交体进行检测。将待测核酸固定于聚苯乙烯管上,加入作为探针的DNA,杂交、洗涤后,加抗杂交体抗体,洗涤后,再加酶标记抗抗体,洗涤,底物显色,观察结果。由于液相杂交速度要快于固相杂交,杂交效率也高,故本法也可用于液相杂交,即先将抗杂交体抗体固定于聚苯乙烯管上,然后将标有生物素的DNA探针与待测RNA在液相中进行杂交,形成的杂交体被抗杂交体所捕获。洗涤后,用亲和素及酶标生物素处理,加入底物显色进行检测,此法多用传染病的检测〔30,31〕。
2.4 重组免疫结合试验(recombinant immuno-binding assay,RIBA)
与免疫印迹法比较,不同之处在于特异性抗原不通过电泳分离转印,而是直接分条加在固相膜上。RIBA已用于血清抗体的测定和分析。在ELISA中一般使用混合抗原包被,检测到的血清抗体是综合性的。RIBA将各种抗原成分以横线条式分别吸附在硝酸纤维素膜的膜条上,放于特制的长条凹槽反应盘中与标本(一抗)和酶标二抗温育和洗涤,最终加底物显色后,显色条带提示血清中存在有针对这一吸附抗原的特异性抗体。根据条带的粗细和显色深浅,还可粗略估计抗体效价。RIBA十分适合于含复杂抗原成分的病原体抗体的分析〔32〕。
2.5 微阵列技术
即生物芯片技术,是20世纪90年代初伴随着人类基因组计划的实施而产生的一门新技术,已成为高效、
