禽大肠杆菌外膜蛋白电泳分析与免疫原性研究

禽大肠杆菌外膜蛋白电泳分析与免疫原性研究 摘要：本研究对禽大肠杆菌强毒株Ｏ_2、O_788，耐药弱毒株O_2（Nor~rChl~s）、O_78(Nor~sChl~r)及O_2（Nor~rChl~s）和O_78(Nor~sChl~r)的融合双价弱毒株O_2.78(Nor~rChl~r)的外膜蛋白(outer membrane protein,OMP)进行了提取和电泳分析，并就后3个耐药菌株的外膜蛋白的免疫原性作了研究。 用Sarkosyl处理和超速离心技术相结合的方法提取各菌株的外膜蛋白，用Bradford法分别测定其蛋白含量，然后经 SDS-PAGE蛋白电泳分析，结果表明各菌株的外膜蛋白主要由3条条带组成，较浓条带的分子量约为36KD，另两条颜色较浅带，一条接近于31KD，另一条带位于43~66.2KD，表明禽大肠杆菌两种血清型Ｏ_2和O_78的外膜蛋白的电泳型相同；它们经药物诱导成耐药弱毒菌株后，外膜蛋白型未发生变化；融合双价弱毒菌株与亲本菌株的外膜蛋白型相同。 将成年小白鼠（18～20g）分成O_2~rOMP、Ｏ-78~rOMP 、O-2.78`rOMP和非免疫对照组四组，前三组分别用经佛氏不完全佐剂乳化的O_2~rOMP、Ｏ_78~r OMP 和O_2.78~rOMP 以肌注方式首免，剂量为50μg/只。首免后第10天用未乳化的O_2~rOMP、Ｏ_78~r OMP 和O_2.78~rOMP进行二次免疫，剂量和免疫方式与首次免疫相同。二次免疫后第10天, 各免疫组小鼠分别用不同剂量的Ｏ_2、O_78强毒菌株经腹腔注射攻击，Ｏ_2的攻毒剂量为100×LD_50、10×LD_50和3×LD_50，O_78的攻毒剂量为180×LD_50，18×LD_50和2.4×LD_50，对照组Ｏ_2、O_78的攻毒剂量分别为3×LD_50、2.4×LD_50。连续观察7天，结果显示，三组免疫小白鼠都可以有效抵抗强毒菌株Ｏ_2、O_78的攻击。表明禽大肠杆菌O_2（Nor~rChl~s）、O_78(Nor~sChl~r)、O_2.78(Nor~rChl~r)的外膜蛋白不仅都具有免疫原性，而且不同血清型菌株的外膜蛋白具有交叉保护作用。 在外膜蛋白对小白鼠的免疫原性试验基础上，进行外膜蛋白对鸡的免疫原性试验。将27d龄的江西土鸡分成O_2~rOMP、Ｏ_78~r OMP、O_2.78~rOMP和非免疫对照组四组，每组40只，前三组分别用经白油乳化的O_2~rOMP、Ｏ_78~r OMP和O_2.78~rOMP抗原以肌注方式免疫，免疫剂量为 200μg/只，各组鸡在同样条件下饲养。免疫后第19天, 从各组鸡中随机取出30只，分成两组，每组15只，分别用强毒菌株Ｏ_2、O_78肌注攻毒，Ｏ_2的攻毒剂量为5×LD_50，O_78的攻毒剂量为4.4×LD_50，另设空白对照组，连续观察2周，结果三组免疫鸡对Ｏ_2的保护率分别为73.33%、73.33%、66.67%，对O78的保护率分别为73.34%、80.00%、66.67%。同时，对未攻毒的免疫鸡进行定期采血，分离血清，用O_2（Nor~rChl~s）、O_78(Nor~sChl~r)和融合株O_2.78(Nor~rChl~r)的外膜蛋白作包被抗原，分别检测各组鸡血清中的IgG抗体，建立了用外膜蛋白作包被抗原检测外膜蛋白免疫鸡抗外膜蛋白IgG抗体的ELISA方法。ELISA检测结果显示各免疫组抗外膜蛋白的IgG抗体在免疫后第28天达到高峰，到第42天仍维持较高水平，且其中任一个菌株的外膜蛋白作包被抗原均可以检测到3个耐药菌株的外膜蛋白免疫鸡产生的IgG抗体，检测的结果为3株菌的外膜蛋白免疫鸡产生的IgG抗体水平基本一致。鸡的免疫保护试验和ELISA法对免疫鸡血清的IgG抗体水平的检测试验进一步说明了外膜蛋白的免疫原性和交叉保护作用。 本研究结果表明，禽大肠杆菌强毒株Ｏ_2、O_78，的外膜蛋白的电泳型相同；两个菌株经药物诱导成耐药弱毒菌株后，外膜蛋白的电泳型仍未改变；两个血清型的融合双价弱毒株的外膜蛋白型与亲本菌株相同；耐药弱毒株O_2（Nor~rChl~s）、O_78(Nor~sChl~r)及融合株O_2.78(Nor~rChl~r)的外膜蛋白具有良好的免疫原性和交叉保护性；用外膜蛋白作包被抗原的ELISA法是检测外膜蛋白免疫血清IgG抗体的有效方法。