20世纪90年代初兴起的人类基因组计划(HGP),其研究重点现已从结构基因组迈向了功能基因组的研究。揭示生命的本质,阐明基因的功能是后基因时代的重要任务,随之而产生的基因芯片(gene chip)技术,为功能基因组学研究提供了强有力的手段。由于基因芯片具有高通量和平行检测等特点,所以该技术自1989年提出并取得国际专利以来〔1-2〕,已经在基因组测序、基因表达及功能分析、基因文库筛选、基因突变检测及基因多态分析、新药物的筛选开发、病原体检测及致病机制研究等方面得到了广泛的应用。这些应用可归分为两大类,一是研究基因的型,即利用基因芯片进行序列分析以及序列的突变和多态性研究;二是对功能基因组的表达进行分析,即表达谱基因芯片的应用。
1 表达谱基因芯片技术概述
表达谱基因芯片是用于研究基因组功能的一种生物芯片〔3-4〕,其技术过程和基本原理与其它基因芯片一样。一般说来其制作过程主要包括:生物学问题的提出和芯片设计;样品制备及探针标记;分子杂交反应;杂交信号检测;数据处理和分析等5个部分。基本原理依然是核酸杂交,即将无数预先设计好的寡核苷酸或cDNA精确、自动、大规模地排列在有多聚赖氨酸包被的硅片或其它固相支持物(如玻璃片、硅片、聚丙烯膜、硝酸纤维素膜、尼龙膜等)上,形成可与目的分子(如基因)相互作用,交行反应(探针竞争性地与同一位点的杂交反应)的固相表面。在激光的顺序激发下,探针上标记的荧光根据实际反应情况,分别呈现不同的光谱,据其波长及波幅特征收集的信号,作出比较和检测,从而迅速得出所要的信息〔5〕。
与其它基因芯片相比,表达谱基因芯片所不同的只是样品标记和检测系统的区别。对于检测细胞内mRNA表达水平的芯片,一般需要从细胞或组织中提取RNA,进行逆转录合成cDNA,并加入偶联有标记物的dNTP,从而完成对靶基因的标记过程〔6〕。近年来运用多色荧光标记,对不同细胞或组织来源的cDNA分别用不同颜色的荧光染料Cyanine3(Cy3,绿色)和Cy5(红色)标记探针,形成Cy3-dNTP和Cy5-dNTP,使它们同时与芯片上的基因进行杂交,通过扫描,比较每个点在不同波长下的荧光强度值及其Cy3/Cy5值(ratio值),从而获得不同样品间差异表达基因的图谱〔7〕。
例如可分别用Cy3-dNTP和Cy5-dNTP标记某种线虫雄虫和雌虫的mRNA,杂交后在雄虫中高丰度表达的基因或只在雄虫中表达的基因其杂交点就应显绿色;而那些在雌虫中高丰度表达的基因或只在雌虫中表达的基因其杂交点就会显红色。而在雌雄虫中表达水平相当的基因则为黄色;在雌雄中均不表达的基因则为无色。这样就可以知道哪些基因分别为雌雄虫体的性别特异基因,而且还可以通过聚类分析推测新基因的功能〔8〕。
对来源于不同个体、不同组织、不同细胞周期、不同发育阶段、不同分化阶段、不同病变、不同刺激下的细胞内的mR-NA或逆转录后产生的cDNA与芯片上的基因片段进行杂交,可以对这些基因表达的个体特异性、组织特异性、发育阶段特异性、分化阶段特异性、病变特异性、刺激特异性进行综合的分析和判断,从而将某个或几个基因与疾病联系起来,确立相关基因功能以及基因与基因间的相互作用关系〔9-12〕。
采用表达谱基因芯片研究基因表达与传统的NorthernBlot相比有许多重要的优点,如检测系统的微型化,在1cm2的芯片上,就可以同时研究上万个基因的表达变化,研究效率显著提高,从而能更多地揭示基因之间表达变化的相互关系,如全世界研究表达谱基因芯片最具有代表性的Affymetrix公司生产的基因芯片〔13〕。另外,表达谱基因芯片检测基因表达变化的灵敏度高,能精确分辨出表达差异在2倍以上的基因。
表达谱基因芯片能同时对成千上万基因的表达进行检测,但是其数据受到很多因素的干扰〔14〕,为提高所得信息的可靠性,进行表达谱芯片优化设计是必要的,如进行芯片优化、探针优化、布局优化等。
作原位合成的支持物在聚合反应前应将其表面衍生出羟基或氨基,并与保护基建立共价连接;作点样用的支持物使其表面带上正电荷(如包被以氨基硅烷或多聚赖氨酸等)以吸附带负电荷的探针分子。表达谱基因芯片常用到表达序列标签(EST),由于EST是基因的子序列,首先必须知道众多的EST序列包含那些基因,对EST片段进行聚类分析,将相互重叠的序列归并成更长的序列,从而作为寡核苷酸探针设计的参考序列〔15〕。为了提高芯片杂交错配辨别能力,有研究者通过动态调节探针的长度及探针之间的覆盖长度,使探针的Tm(解链温度)基本保持一致,从而提高检测结果的可靠性〔16〕。为增加探针的特异性,设计的探针之间尽可能不重叠或少重叠〔17〕。
2 表达谱基因芯片在兽医学中的应用
表达谱基因芯片在兽医学研究领域中已逐步得到应用,并呈现出了其强大的功效,通过检测基因表达水平差异,为阐明不同状况下的基因功能,推断基因与基因的相互关系,揭示基因与疾病的内在联系并发现可能的诊断及药物作用靶基因等方面提供了有力的工具。现今的研究主要集中在动物病原的基因表达图谱分析,基因功能研究以及药物靶基因筛选等方面,这为阐明病原相关基因功能,探索动物疾病机制,研制新药物等领域提供了广阔的应用前景。
2.1 基因功能的研究 应用表达谱基因芯片研究未知基因的功能,是表达谱芯片最重要的用途之一,根据与未知基因表达图谱一致或相似的已知基因,推测该新基因的功能。澳大利亚墨尔本大学Nisbet和Gasser〔8〕,通过构建脆弱毛圆线虫(Trichostrongylus vitrinus)雌虫和雄虫的消减文库,利用表达谱基因芯片分析了716个EST序列,并与已报道过的秀丽新杆线虫(Caenorhabditis elegans)相比较,发现有391个ESTs与C.elegans同源,62个与其它种的寄生性线虫同源,263个基因存在表达差异。表达谱分析表明,716个ESTs中,561个是与性别相关的功能特异基因,其中包括编码雄虫特异的蛋白激酶、蛋白磷酸酶和主要精子蛋白基因,以及编码雌虫特异性的卵黄蛋白、热休克蛋白基因等。
Boyce等〔18-19〕利用表达谱基因芯片研究了引起禽霍乱的巴氏杆菌在不同组织和培养基中的表达差异,当病原入侵红细胞时,有40个基因的表达呈现出差异性,其中有17个是上调基因,23个为下调基因;而病原入侵肝脏时,93个基因的表达有差异,包括49个上调基因,44个下调基因。大部分的上调基因与氨基酸、碳水化合物的产生、转运及代谢密切相关,这些基因在巴氏杆菌自身的生化合成和能量代谢的途径调控中发挥着作用;下调基因的功能目前尚不是很清楚。有趣的是该研究还发现,在病原体生长过程中,缺乏铁元素对基因的表达差异表现不明显,这表明宿主在感染巴氏杆菌时,缺铁不是主要症状。
大肠杆菌O157∶H7是人肠道中主要病原体之一,也存在于牛的消化道中。Chitko-McKown等〔20〕对培养牛巨噬细胞的培养基用大肠杆菌O157∶H7脂多糖(LPS)处理后,研究牛巨噬细胞基因表达的变化情况。用LPS处理过的巨噬细胞,其反转录的cDNA与人的基因芯片进行杂交,发现44个基因的表达存在差异,其中有18个基因是牛的巨噬细胞新基因,包括TNF诱导基因、干扰素诱导基因、细胞凋亡抑制基因等。该表达谱芯片首次将牛和人的基因进行杂交,通过利用人的已知基因,为开展动物新基因功能的研究提供了参考价值。
2.2 动物发病机制的研究 疾病的发生多是由于正常的生理状态下基因表达发生改变的结果。通过监测发病组织细胞的基因表达变化,可以了解疾病发生、发展、转归的相互联系,从而明确疾病发生机制,为诊断或寻找治疗靶位基因提供线索。
表达谱基因芯片通过分析基因表达时空特征,检测基因表达差异。如Morimoto等〔21〕为了研究猪蛔虫第四期幼虫的移行致病作用机制,首先构建了感染21d后寄生在猪空肠的第四期幼虫(L4-21-J)的cDNA文库,并筛选了1920个克隆点样在芯片上,分别用Cy5标记探针L4-21-J,用Cy3标记探针L3、L4-14-J、L4-21-I、L5进行杂交分析,发现编码肌动蛋白、核糖体蛋白、磷酸脱氢酶和琥珀酸脱氢酶的基因只在L4-21-J中呈高效的表达。这些蛋白因子与抵抗宿主的保护性免疫密切相关,这表明猪蛔虫第四期幼虫移行在空肠期间是产生明显免疫逃避的阶段。
微小隐孢子虫属于胞内寄生性原虫,广泛寄生于哺乳动物,也给人类的健康构成很大的威胁。美国明尼苏达大学Deng等〔22〕研究了宿主细胞在感染微小隐孢子虫24 h后其基因表达的情况,发现宿主细胞中223个基因的表达受到微小隐孢子虫的调控,其中有125个被上调,98个被下调,他们用RT-PCR进一步验证编码了宿主细胞的热休克蛋白、炎症趋化因子IL-8、肌动蛋白、微管蛋白等13个基因与上调基因是一致的。该研究应用表达谱芯片揭示了宿主感染微小隐孢子虫后宿主细胞生化途径的改变,阐明了微小隐孢子虫的发病机制,进一步揭示了宿主和寄生虫之间的相互作用。
2.3 药物研究中的应用 表达谱基因芯片应用于新药的研发,主要目标就是在基因表达水平差异的基础上,寻找药物靶标,通过比较不同正常组织间mRNA的表达谱,来选择只在特异组织中才表达的蛋白作为筛选的靶位,通过这种选择,可以显著地减少药物对整体产生的不良反应。正常组织发生病变时,其相关基因的表达也随之而变化,这种变化可能是病变的原因,也可能是病变的结果,那么针对此基因靶位筛选的药物就应具有逆转病变或减轻病变的功效。表达谱基因芯片还可以用于药物作用后基因表达变化的研究。例如Marton等使用含有6065个酵母的ORF的DNA表达谱基因芯片检测,提出了“解码器战略(decoder st
