mRNA-DDRT-PCR技术在农林生产上的应用 - 植物学

mRNA-DDRT-PCR技术在农林生产上的应用——帮写论文 Abstract: mRNA differential display technique is a newly developed method for normal and abnormal cell separation and cloning of differentially expressed genes between PCR method, is currently screening of differentially expressed genes is one of the effective methods. Since its inception in animal genetic and breeding has made great achievements, widely used in human and other animal growth gene regulation, gene cloning research. In the research of plant genes application start later, is now used for plant genetic analysis of heterosis mechanism, and so on. Here, this paper introduces the mRNA differential display technology principle, steps, advantages and disadvantages and its development, and the plant specific gene separation of research and its application prospect do discuss. 摘要：mRNA差别显示技术是近年发展起来的一种用于分离和克隆正常与异常细胞之间差异表达基因的PCR方法,是目前筛选差异表达基因的有效方法之一.自问世以来在动物遗传育种方面取得了很大的成绩,广泛用于人类及其他动物生长发育基因调控、基因克隆的研究.在植物基因研究方面应用起步较晚,现已开始用于植物基因分析、杂种优势机理等方面的研究.在此,该文介绍了mRNA差别显示技术的原理、步骤、优缺点及其发展,并对其在<A href="http://www.51lunwen.org/jxsxbg/2011/0704/lw201107041157579830.html" target=_blank>植物</A>特异基因分离方面的研究及其应用前景做了探讨. 关键词：mRNA差别显示；植物；特异基因 真核生物一般有10万个不同的基因,而在单个细胞中,仅有约15%的基因得到表达,产生约15 000种mRNA.正是由于这种基因表达的差异,使得各种生命现象得以有序地进行,因此研究基因转录成为研究生命现象的重要领域.比较不同条件下细胞内基因表达的变化,可以帮助我们了解控制生命过程的机理,并发现具有特殊功能的表达产物.mRNA差别显示技术是美国哈佛医学院的PengLiang[1]和Str-uss[2]于1992年发明的一种用于分离和克隆哺乳动物正常与异常细胞之间差异表达基因的PCR方法,简称DDRT-PCR(mRNAdifferential display reverse tran-scription PCR).该技术带来了方法学上的重要突破,为揭示细胞生理过程的分子机制提供强有力的技术支持.这一技术在<A href="http://www.51lunwen.org/jxsxbg/2011/0704/lw201107041157579830.html" target=_blank>植物学</A>研究中具有广阔的应用前景. 1.mRNA差别显示技术的基本原理 真核基因mRNA分子的3′末端绝大多数都带有一段Poly(A)尾巴.在这段Poly(A)序列起点碱基之前5′上游的两个碱基有12种组合(CG、GG、AG、TG、CT、GT、AT、TT、CC、GC、AC、TC),根据这种序列结构特征,按照碱基配对原则,人工合成Oligod(T)引物时,在其3′端加上两个碱基(5′T12MN,M为A、G、C中任一种,N为A、G、C、T中任一种).因此引物可将1/12的mRNA反转录成cDNA,并用此引物锚定cDNA第二条链的3′端,用另一个随机寡核苷酸引物组成的5′端引物与cDNA第一条链互补进行PCR扩增,由于5′端随机引物结合在cDNA的互补靶点上,来自不同mRNA的扩增片段大小有差异,对PCR产物进行电泳,染色或扩增时用32S标记的dATP代替dATP在测序胶上自显影,即可显示差异表达的cDNA片段.从理论上讲,用12种Oligod(T)锚定引物,20种5′端随机引物组成的全部240组引物对PCR扩增,就能产生出20 000条左右的cDNA条带,其中每一条都代表着一种特定mRNA.这个数字大体上涵盖了在一定的发育阶段某种类型细胞中所表达的全部的mRNA数.通过mRNA差别显示技术,可以比较不同细胞群或器官基因表达类型,同时比较调控表达基因的数量变化及在不同条件下差异调节的基因. 2.mRNA差别显示技术的操作步骤 高质量RNA是开展mRNA差别显示的基础.首 先提取无污染的RNA或mRNA,在含有RNA(mRNA)、 5′T11-12MN、3′引物、Rnase抑制剂(Rnasin)、反转录酶、dNTP、DDT、DEPC处理水及反转录缓冲液体系内进行反转录反应,合成cDNA第一条链;然后以反转录产物为模板,在5′T11-12MN、3′寡核苷酸引物、MgCl2、dNTP、Taq酶、ddH2O及PCR缓冲液体系内进行PCR扩增.产物通过测序胶电泳,染色或自显影显带,分离并纯化不同的差异条带,取部分差异cDNA片段放射性标记后做探针,与总RNA作Northern杂交,斑点杂交以排除假阳性片段,同时将获得的差异片段进行克隆,并与基因序列数据库中的序列作同源比较.如获得新的基因片段,可申请登记入库. 3.mRNA差别显示技术的优缺点 对基因表达的研究过去主要采用减法杂交和蛋白质双向电泳技术.蛋白质双向电泳只能粗略地比较两种细胞内产生的蛋白质,不能直接从基因水平分析鉴定,因而很难推广.减法杂交需建立cDNA文库,通过两次杂交分离去除双链分子,再将余下的单链分子同文库进行杂交,这种方法不仅技术复杂费时,且重复性差.而mRNA差别显示技术简单易行,RNA用量少,灵敏度高,可同时比较不同发育阶段、不同器官组织细胞内mRNA样品的差异,且重复性好.mRNA是目前筛选差异表达基因最有效的方法[3,4].该技术自问世以来,已广泛应用于动物、植物及人类疾病研究的各个领域.但也有不足之处,主要表现在所得特异性cDNA克隆会出现假阳性,有放射性污染且产物的量受mRNA丰度及引物的影响. 4.mRNA差别显示技术的改进 针对其缺陷,不同学者进行了多方面的改进[5~10].改进主要是从引物的设计、PCR循环参数、假阳性鉴定、防止放射性污染等方面进行的.1994年ITO等改进了3′端Polyd(T)锚定引物,把12条引物精简为T12A、T12C、T12G等3条,大大简化了操作程序.1995年Ayala[5]等在3′端锚定引物和5′端随机引物上分别加CGGAATTCGG和CGTGAATTCG10个碱基,使两端都带上EcoRI酶切位点,显著增加了敏感性和重复性.1996年GenHunter[6]公司使3′端锚定引物和5′端随机引物分别带上了HindIII酶切位点,引物数分别减为3条和8条,而碱基数分别增加18个和13个,这样经计算机同源性分析表明,所得到的24个组合同样能覆盖所有mRNA,使操作和后续处理更加简便.Odeberg[7]等用生物素标记的3′端Polyd(T)MN结合mRNA,避免了同位素带来的损害,同时可对量特别少的样品进行差异显示PCR.1995年Sompograe[8]等用细胞质RNA反转录,PCR循环次数减为30次,湿胶直接放射自显影等方法消除假阳性.Reeves[9]等提出了LLR技术,把PCR产物直接克隆在PCRTMII载体上,然后用T7启动子引物起始PCR扩增,产物直接测序.Fischer[10]等把mRNA差异显示技术和限制片段多肽性(RFLP)结合起来,建立了RCDDP技术(RFLP coupled domain directed differen-tial display)用于分析多基因家族疾病的差异表达基因.利用改进技术已在鉴别和克隆人体某些组织差别表达的基因获得成功.