1材料与方法
1.1材料､主要试剂及仪器
胎牛血清购自杭州四季青公司,L-DMEM､谷氨酰胺､羧甲基纤维素及胰蛋白酶均购自GIBCO公司,Cell proliferation ELISA BrdU(col-orimetric)试剂盒购自Roche公司;主要仪器有倒置显微镜(Nikon)､CO2培养箱(Thermo)､全自动酶标仪(美国通用)｡红景天由盈康科技控股国际有限公司提供,人脐静脉内皮细胞(HUVEC)由贵州医科大学免疫学教研室保存｡实验用BALB/c小鼠及SD大鼠(SCXK,黔2002-0001)由贵州医科大学实验动物中心提供｡
1.2红景天含药血清对HUVEC的增殖作用
取SD大鼠16只,体质量(350±20)g,随机分为对照组及红景天给药组,雌雄各半｡红景天给药组将红景天粉剂混悬于0.5%羧甲基纤维素,灌胃剂量5.6g/(kg·d);对照组每天灌服等体积0.5%羧甲基纤维素,两组均连续灌胃7d｡末次给药2h后水合氯醛麻醉,股动脉取血,37℃静置2h,3000r/min离心10min,取上清收集含药血清,0.22μm微孔滤膜除菌,56℃,30min灭活,分装,-20℃保存备用｡
1.2.2 HUVEC培养
将生长良好的HUVEC细胞用0.25%胰蛋白酶消化,用含10%FCS L-DMEM调整细胞浓度为5×107个细胞/L,按100μL/孔接种于96孔板,37℃培养24h,待细胞贴壁后,换无血清L-DMEM饥饿培养24h备用｡
1.2.3实验分组
将上述96孔板细胞分为含药血清高､中､低剂量组和正常血清高､中､低剂量组,含药血清高､中､低剂量组HUVEC使用的L-DMEM培养液中分别含4%､2%及1%的含药血清;正常血清高､中､低剂量组HUVEC使用的L-DMEM培养液中含4%､2%及1%的正常血清,各组细胞37℃培养48h｡
1.2.4细胞增殖能力检测
向上述96孔板中各组细胞内加入BrdU(终浓度10mg/L),37℃孵育4h,按Cell proliferation ELISA BrdU(colorimetric)试剂使用流程操作,于酶标仪450nm处检测吸光度(OD)值｡实验重复两次,设3个复孔｡
1.3红景天对小鼠皮肤创伤的愈合作用
1.3.1实验分组
取BALB/c小鼠,体质量(20±2)g,随机分为对照组及红景天高､中､低剂量组[4､2及1g/(kg·d)溶于0.5%的羧甲基纤维素]｡每组10只,雌雄各半｡
1.3.2建立创伤修复模型
乙醚麻醉小鼠,10%NaS背部脱毛,油脂护皮,距脊柱两侧各1.5cm的皮肤上打2个圆形创面,深至皮下,建立皮肤创伤模型｡造模后小鼠伤口暴露,单笼饲养｡创伤第1天开始灌胃高､中､低剂量红景天混悬液,对照组灌服等体积0.5%羧甲基纤维素,1次/d,连续7d｡创伤后第1天起隔日用数码相机记录小鼠背部创伤面积直至愈合｡
1.3.3小鼠皮肤创面愈合率测定
应用ImageJ医学图像分析软件,勾勒溃疡面轮廓,得出像素平方值,同时用描记笔勾勒标尺上1cm的直线距离,得出1mm直线距离的像素值,再将1mm像素值相乘,得出1mm2面积的像素平方值,最后用溃疡表面轮廓的像素平方值除以1mm2面积的像素平方值,则为小鼠背部创面面积;愈合率=[(原创面面积-现创面面积)/原创面面积]×100%｡
1.3.4创面愈合质量评价
创面愈合后将各组小鼠处死,取创面组织置于10%中性福尔马林固定,石蜡包埋,HE染色｡分析组织愈合情况｡
1.4统计学方法
数据均采用SPSS 11.5进行处理,数据以均数±标准差(x±s)表示,吸光度值采用t检验,小鼠背部创面愈合率采用单因素方差分析,用imageJ软件分析各组小鼠创面愈合率,以P<0.05为差异有统计学意义｡
2结果
2.1红景天含药血清对HUVEC的作用
BrdU掺入法结果表明,含药血清高剂量组的OD值显著高于同浓度正常血清对照组(P<0.05),其余含药血清两组与同浓度正常血清对照组比较,差异无统计学意义(P>0.05)｡说明高浓度含药血清能促进HUVEC增殖｡探讨红景天促进皮肤创伤愈合的作用及机制｡将培养获得的人脐静脉内皮细胞(HU-VEC)分为含药血清高､中､低剂量组,正常血清高､中､低剂量组,采用BrdU掺入法检测HUVEC细胞增殖;40只BALB/c小鼠采用打孔法制作背部皮肤损伤模型,将小鼠随机分为红景天高､中､低剂量组及正常对照组,分别给予高､中､低剂量红景天混悬液及0.5%羧甲基纤维素灌胃,于创伤第3､5､7､9､11及13天测量背部创伤面积,计算愈合率;第13天取皮肤组织做病理切片观察组织愈合情况｡4%含药血清对HUVEC的增殖促进作用显著高于同浓度正常血清(P<0.05);红景天灌胃高､中､低剂量组小鼠创面面积与对照组比较明显减小;第7天､9天､11天及13天红景天高､中､低剂量组小鼠创面愈合率高于对照组(P<0.05);组织学检查发现毛细血管及胶原增生与红景天灌胃呈一定剂量依赖关系｡
红景天可以显著促进皮肤创伤的修复,机制与其促进血管内皮细胞增殖,促使血管新生,改善创伤部位新生肉芽组织血供有关｡
小鼠创面情况见图1,红景天灌胃低､中､高剂量组创面面积与对照组比较明显减小,创伤后第7天､9天､11天及13天,红景天高､中､低剂量组小鼠创面愈合率高于对照组(P<0.05)｡
2.3皮肤创面组织学检查
HE染色可见,对照组可见毛囊修复,残存毛细血管挤压式扩张;红景天灌胃低剂量组纤维组织少量增生,细胞和胶原增生相对活跃,排列较杂乱,残存数个毛细血管,扩张开放;红景天灌胃中剂量组少量纤维组织层,胶原增生硬化明显,静止形态;红景天灌胃高剂量组纤维组织及胶原量丰富,增生明显,毛细血管增多,血窦样扩张｡3讨论
皮肤创伤修复可分为炎症应答期､结构重塑期和再上皮化3个阶段｡为了有效的完成修复过程,需要成纤维细胞､血管内皮细胞等多种细胞的参与｡创伤愈合是指机体受到外力作用使皮肤等组织出现离断或缺损后的愈合过程｡包括各种组织的再生和肉芽组织增生,瘢痕形成等｡
血管的形成是伤口愈合和组织再生过程中的重要环节,血管内皮细胞是位于循环血液与血管内皮下组织之间的单层细胞,它不仅是一道机械屏障,还有物质转运､分泌细胞因子等多种功能｡血管内皮细胞的增殖对血管新生以及创面愈合有非常重要的作用,近年来发现许多中草药对于皮肤的创伤和慢性疾病造成的皮肤溃疡具有独特疗效,中草药中的一些有效成分对创面生长因子的分泌有促进作用｡
红景天作为传统中药,在许多典籍中都有活血通瘀,强健机体的记载｡GuptaA等报道经红景天灌胃后的大鼠皮肤创伤愈合情况较阳性对照聚维酮碘软膏处理组好,其增加肉芽组织内的抗氧化剂水平可能是主要机制之一｡
国内有研究认为红景天浸出液有抑制HUVEC生长的作用｡也有学者认为,用红景天的粗药制剂直接进行体外实验容易造成一些阴性或假阳性结果｡而用血清药理学方法来研究红景天对HUVEC的作用更具备科学性､有效性｡本文对红景天含药血清促进HUVEC增殖的情况进行了探讨｡结果表明4%含药血清对HUVEC增殖具有明显地促进作用｡
通过红景天对小鼠皮肤创伤愈合的研究发现愈合中后期(7~13d),红景天灌胃各剂量组小鼠背部皮肤创面愈合率均高于对照组,且组织学检查可见红景天各剂量组创伤愈合部位毛细血管形成及胶原增生较正常对照组多｡说明红景天促进小鼠背部皮肤创伤愈合的机制与创面血管内皮细胞增殖,血管新生促进局部血供增加,加快
