本文是一篇农业管理论文，本研究通过转录组测序发现随着周龄的增加，差异表达基因显著富集在跨膜蛋白转运活性、阴离子跨膜转运蛋白活性、离子跨膜转运蛋白活性等与离子转运相关的通路；并筛选出 ATP2B2、CCKAR、HTR2B、KRT19、FKBP5 等基因，这些候选基因可能是通过影响蛋壳质量从而影响种蛋的孵化性能。
1 文献综述
1.1 蛋壳的结构和形成过程
1.1.1 蛋壳的结构
蛋壳是在生理温度下快速形成的具有高度有序和矿化的结构[1]。蛋壳的厚度、整体形状、颜色等因物种而异，但其总体结构在所有禽类中基本相同。对于鸡蛋壳而言，主要是由 95% 的碳酸钙和 3.5% 的蛋白质组成[2]，其结构大致可以分为三层：内部是富含半胱氨酸的蛋白质壳膜；中间部分是坚硬的矿化层，主要是由碳酸钙方解石晶体与基质蛋白、糖蛋白、蛋白聚糖组成，作为整个蛋壳结构中最坚硬的部分，矿化层起到保护鸡蛋内容物的作用；最外层是非矿化的角质层，角质层是一个天然的物理抗菌屏障，保护鸡蛋免受微生物的侵袭。蛋壳上有无数气孔，可以帮助鸡蛋内部与外界完成水和气体交换，对于胚胎发育至关重要。
蛋壳超微结构由内到外可分为 6 部分：蛋壳内外膜、乳突层、栅栏层、垂直晶体层、角质层。蛋壳内外膜是由交错的蛋白质纤维组成的网状结构，由高度交联的胶原蛋白（I型、V型、X型）和糖蛋白等组成[3, 4]。蛋壳膜主要成分是蛋白质，包含 CREMPs、AvB Ds、组蛋白、OCX-36、LOXL2等蛋白质家族[4]，还含有硫酸软骨素[5]、透明质酸、唾液酸等营养成分，这些物质为蛋壳膜包裹蛋清提供基础，同时也是抵御病原微生物入侵的物理屏障。蛋壳内膜厚约 20 μm，与蛋清直接接触，主要功能是包裹蛋清，允许水、气体（尤其是氧气）和矿物质交换。蛋壳外膜厚约 50 μm，位于内膜和钙化部分之间，为矿化过程提供结构支持。蛋壳膜的形成过程或结构遭到破坏，都会影响蛋壳正常矿化过程。
1.2 蛋壳质量的评价指标
我国禽蛋需求量巨大，据国家统计局数据显示，仅 2023 年，我国禽蛋产量就达 3563 万吨[13]。随着禽蛋产量的增加，约有 11% 的禽蛋在运输过程中破损，损失高达 210 亿元[14]，给经济造成巨大的损失。在此背景下，蛋壳质量逐步成为研究的主要领域之一。蛋壳质量主要包括蛋重、蛋形指数、蛋壳厚度、蛋壳强度等多个指标。
影响蛋重的因素有很多，其中包含储存时间、品种、年龄等。通常情况下，蛋重可以作为评价鸡蛋新鲜程度的一个指标。若储存时间过久，则会导致鸡蛋内部水分不断蒸发，从而使其变轻，这样的鸡蛋即称为不新鲜的蛋。研究表明[15, 16]，长顺绿壳蛋鸡的蛋重约为 47.45 g、赤水乌骨鸡蛋重约 50.95 g、乌蒙乌鸡蛋重约 48.54 g、海兰褐蛋鸡的蛋重约 61.79 g。且蛋重会随着母鸡周龄的增加而增加，产蛋末期的禽蛋重高于产蛋前期。
蛋壳厚度作为衡量鸡蛋的重要质量指标和经济指标，受到品种、日龄、营养水平等多方面因素影响[17-21]。通常蛋壳厚度是指鸡蛋钝端、尖端和赤道部三个部位所测结果的平均值。已有研究表明，不同品种之间蛋壳厚度有所不同。朱伟[22]通过比较阿克鸡、武定鸡和海兰褐蛋鸡之间的蛋壳厚度，发现阿克鸡的蛋壳厚度为 0.32 mm、海兰褐蛋鸡的蛋壳厚度为 0.33 mm，显著高于武定鸡的蛋壳厚度（0.30 mm）。蛋壳厚度随着周龄增加而降低，Cristina[6]研究发现 33 周龄母鸡所产鸡蛋的蛋壳厚度显著高于 45 周龄和 67 周龄母鸡所产鸡蛋的蛋壳厚度。此外，饲粮中添加有机微量矿物质能显著提高蛋壳厚度[23, 24]。通常优良的蛋壳厚度在鸡蛋长途运输和种蛋长期保存中更具有优势。
3 海兰褐父母代不同周龄种蛋孵化性能分析
3.1 材料与方法
3.1.1 试验材料与方法
于 2022 年 4 月至 2023 年 6 月追踪测定海兰褐父母代种蛋从 23 周龄至 74 周龄的孵化情况，每批约 40 万枚种蛋入孵，孵化在晓鸣农牧股份有限公司完成。使用箱体式自动孵化器进行孵化，入孵 18 天落盘，并剔除无精蛋和死胚蛋，统计受精蛋数，计算死胚率、受精率。待 21 天出雏后，统计受精蛋孵化率、入孵蛋孵化率。受精率=受精蛋/入孵蛋数×100%；死胚率=死胚数/受精蛋数×100%；受精蛋孵化率=出雏数/受精蛋数×100%；入孵蛋孵化率=出雏数/入孵蛋数×100%。
3.1.2 数据处理
用Excel 2016 对数据进行初处理，使用 SPSS 26 进行单因素 ANOVA 分析、回归分析以及Pearson 相关性分析，结果用平均值±标准差表示，使用 Graphpad Prism 8 进行作图。用 RStudio 软件，采用 Ward.D 法进行聚类分析。
3.2 试验结果
3.2.1 种蛋孵化性能随周龄变化情况
海兰褐父母代从 23 周龄至 74 周龄的种蛋孵化性能如图 3- 1 所示：随着周龄增加，种蛋受精率从 23 ~33 周龄呈现出持续增加的趋势。34 周龄后，种蛋受精率维持在一定范围内，趋于稳定。受精蛋孵化率和入孵蛋孵化率随周龄变化趋势基本一致。由表 3- 1 可知，受精蛋孵化率和入孵蛋孵化率总体上随周龄先上升后下降，呈抛物线状（R2 > 0.5，P < 0.01）。
为更进一步分析种蛋孵化性能随周龄的变化情况，将孵化性能按周龄划分为 23 ~ 31 周龄组、32 ~ 49 周龄组、50 ~ 61 周龄组、62 ~ 74 周龄组。由表 3- 2 可看出，32 ~ 61 周龄种蛋的受精率显著高于其他两组（P < 0.05）；23 ~ 31 周龄组种蛋死胚率最高，显著高于其他组（P < 0.05）；32 ~ 49 周龄组的受精蛋孵化率和入孵蛋孵化率最高，显著高于其他各组（P < 0.05）。
3 海兰褐父母代不同周龄种蛋孵化性能分析 ................... 15
3.1 材料与方法 ............................ 15
3.1.1 试验材料与方法 .......................... 15
3.1.2 数据处理 ................................ 15
4 不同周龄种蛋蛋壳质量变化及与孵化性能的相关性分析 .............. 22
4.1 材料与方法 .................... 22
4.1.1 试验材料 ................................ 22
4.1.2 试验方法 ........................... 22
5 影响蛋壳质量的子宫部转录组分析 ...................... 34
5.1 试验材料 ........................... 34
5.1.1 试验动物 ........................... 34
5.1.2 主要试剂及来源 ............................ 34
5 影响蛋壳质量的子宫部转录组分析
5.2 试验方法
5.2.1 不同周龄子宫部RNA高通量测序
5.2.1.1 RNA文库构建 转录组文库的构建及测序由广州基迪奥生物科技有限公司完成。不同产蛋期的子宫部组织样RNA 检测合格后，通过带有 Oligo（dT ）的磁珠富集具有 poly A 尾巴的真核 mR NA 后，用缓冲液把 mR NA 打断。以片段化的 mR NA 为模版，随机寡核苷酸为引物，在 M-MuLV 逆转录酶体系中合成 cD NA 第一条链，随后用 RNaseH 降解 RNA 链，并在 DNA polymerase I 体系下,以 dNTPs 为原料合成 cDNA 第二条链。纯化后的双链 cDNA 经过末端修复、加 A 尾并连接测序接头，用 AMPure XP beads 筛选 200 bp 左右的 cD NA，进行 PCR 扩增并再次使用 AMPure XP beads 纯化 PCR 产物，最终获得文库。
5.2.1.2 测序数据质控、比对及转录本组装
为了保证数据质量，在信息分析前对原始数据进行数据过滤，以减少无效数据所来带的分析干扰。首先，对下机的原始测序序列数据（Raw reads）利用 FASTP 进行质控，过滤低质量数据得到 clean reads。过滤过程主要包括去除低质量 Reads（质量值 Q ≤ 20 的碱基数占整条 Read的 50% 以上)、含 N 比例大于 10% 的 Reads、带接头的 Reads。
6 全文总结
1、从 23 ~ 31 周龄，随着种鸡周龄增加，其种蛋受精率、孵化率增加，死胚率下降，在 32 ~ 61 周龄时，种蛋受精率维持在 95.5% 以上；32 ~ 49 周龄，种蛋的孵化性能最佳，受精蛋孵化率达到 91.5% 以上；50 ~ 61 周龄次之，受精蛋孵化率在 90.5% 以上。62 周龄后，种蛋的孵化率显著降低，受精蛋孵化率平均为 87.1%。
2、随着种鸡周龄的增加，蛋重、蛋形指数逐渐增加；蛋壳强度、蛋壳厚度、蛋壳重、蛋壳比例呈现出先上升后下降的趋势；产蛋后期蛋重过大种蛋、低蛋壳强度的种蛋、蛋壳超微结构中异常乳突体种蛋出现频率增加。蛋壳垂直断裂面的整齐度和致密性下降可能是产蛋后期蛋壳质量下降的原因。而蛋壳质量与孵化性能之间的相关主要是由于蛋重、赤道部厚度和尖端厚度与受精蛋孵化率之间的显著相关引起的。
3、通过转录组测序发现随着周龄的增加，差异表达基因显著富集在跨膜蛋白转运活性、阴离子跨膜转运蛋白活性、离子跨膜转运蛋白活性等与离子转运相关的通路；并筛选出 ATP2B2、CCKAR、HTR2B、KRT19
