本文是一篇农业论文，本文共分为两部分，第一部分为水稻抗白叶枯病基因 x349 的精细定位，第二部分主要是两个水稻类病斑早衰突变体的图位克隆。结论如下：1. 通过对国内外 31 个白叶枯病多菌系接种鉴定及抗谱分析表明突变体 x349 中含有一个广谱抗白叶枯病新基因。以感病材料 JG88 与抗病材料 x349 配制杂交组合，构建了含有 2290 个单株的 F2 分离群体，根据构建的 F2 群体抗感单株分离比，说明该抗白叶枯病性状由单隐性基因控制。新开发了 9 对在抗感亲本之间具有多态性良好的插入缺失（Indel）分子标记，分别为 ID45、ID80、ID84、ID90、ID48、ID51、ID62、ID74 和 ID69。通过连锁分析，将抗白叶枯病基因 x349 定位在水稻第 2 染色体长臂末端标记分子标记 ID90 和 ID74 之间，物理距离大约 90.6kb。
第一章 绪论
1.1 水稻白叶枯病与病原菌 Xoo
1.1.1 白叶枯病概述水稻作为全世界广泛种植的粮食作物之一，其产量对于粮食安全问题至关重要。由病原菌Xoo 引起的水稻白叶枯病（Bacterial blight, BB）已经成为水稻种植生产中影响程度最大的细菌性病害之一，且与另外两种病害：稻瘟病、纹枯病并称为制约水稻高产的水稻三大病害。19 世纪80 年代，水稻白叶枯病首次在日本福冈水稻种植区被发现，20 世纪 50 年代以来，白叶枯病发病面积和范围逐步扩展，以致于在世界各国水稻田间均被分离发现（Mew, 1987）。经研究，水稻白叶枯病是维管束类型病害，在田间自然情况下，病原菌 Xoo 主要通过伤口入侵水稻寄主，在维管束组织中不断增殖产生胞外多糖黄原胶阻塞输导组织，导致叶片失水产生灰褐色或白色病斑，进而蔓延至整个植株发生萎蔫卷曲以致枯死。一般情况下水稻感染白叶枯病后产量减少 20-30 %，发病情况较为严重可能减产 50 %，在分蘖期遭受白叶枯病的感染能够影响籽粒灌浆导致大幅度减产导致颗粒无收（REDDY et al., 1989）。
早在 20 世纪 30 年代我国就有白叶枯病的发生，进入 50 年代末期，随着矮杆品种的推广种植和密植集约型栽培措施的推广，导致白叶枯病在全国范围内迅速扩展蔓延，成为严重制约我国水稻高产、稳产的因素。目前防治白叶枯病主要有两种措施：使用药物喷施的化学防治法和挖掘抗病基因培育种植抗病品种。由于是维管束病害，所以施用药剂防治可能效果不佳，而且污染环境。因此种植抗病品种是最经济、有效的措施（SUH et al., 2013），而不断挖掘新的广谱抗病基因实现多基因聚合是水稻抗病育种的前提（李定琴 等，2017）。
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1.2 水稻抗白叶枯病基因研究进展
自 1960 年以来，国内外科学家一直致力于开发新的水稻抗病基因资源（章琦，2005）。水稻代表品种全基因组测序的完成，包括日本晴、蜀恢 498 和 9311 等。这一研究成果的完成大大加速了白叶枯病基因定位与克隆的研究进展。迄今为止，水稻中已有 Xa1、Xa2/Xa31(t)、Xa3/Xa26、Xa4、xa5、Xa7、Xa10、xa13、Xa14、Xa21、Xa23、xa25、Xa27、xa41(t)和 Xa45(t)共 15 个抗白叶枯病基因被成功克隆，这些抗病基因编码了不同类型的蛋白质，揭示了抗病基因介导的黄单胞杆菌水稻致病变种（Xoo）抗性的多重机制。根据其抗病机理的不同，大致分为以下几种类型。
表 1-1 已克隆的水稻抗白叶枯病基因
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第二章 水稻抗白叶枯病基因 x349 的精细定位
2.1 实验材料
2.1.1 定位群体的构建
突变体 x349 于 2018 年 5 月种植于北京顺义实验基地，以抗白叶枯病突变体 x349 作为父本，常用籼稻品种 JG88 作为母本进行杂交，10 月份获得 F1 代杂交种。F1 代种子同年 12 月种植在海南三亚崖州南滨农场，对 F1 代进行接种鉴定。F1 代自交后收种得到 F2 代。F2 代种子于 2019 年 5月种植于中国农业科学院作物科学研究所北京顺义实验基地，接种之后，对抗白叶枯病和感白叶枯病的植株数目进行精确统计，计算 F2 代群体分离比。根据 F1 代抗感表型和 F2 代抗感单株分离比，对 x349 进行遗传分析。
2.1.2 鉴定菌株
本研究用于接种鉴定的白叶枯病菌菌株均保存于本实验室。其中 P1、P2、P3、P4、P5、P6、P8、P9、P10 来源于菲律宾；T1、T2、T3 来源于日本；C1、C2、C3、C4、C5、C6、C7、WCL、GX15-2、Yun17-3、Yun18-2-2、LC-4、LN44 来源于中国；KXO19、KXO85、KXO576 来源于韩国；PP8511、TL9924、CN9417 来源于孟加拉国。
2.1.3 培养基及其它试剂
NA 培养基：琼脂 16g，蔗糖 10g，多聚蛋白胨 5g，酵母粉 1g，牛肉浸膏 3g，调 PH 至 6.8，定容至 1L，121℃高压灭菌 20min。
50×TAE：Tris 242g，冰醋酸 57.1 mL ，0.5 mol/L EDTA100 mL (pH=8.0)，搅拌均匀定容至 1L，使用时稀释至 1×。PCR 扩增所用的 Mix 和 DNA Polymerase 均购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司；DNA胶回收纯化试剂盒购自上海生工生物工程股份有限公司；其它化学试剂均为国产分析纯，产自北京化工厂。琼脂糖购自北京沃比森科技有限公司。
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2.2 实验方法
2.2.1 白叶枯病菌的培养、接种、鉴定
接种所用的白叶枯病菌菌株保存于-80℃冰箱中，取出在 NA 培养基上复壮培养，置于 28℃培养箱遮光暗培养 2-3 天，轻轻刮取培养基上的菌斑溶解于无菌水中配制接种所需菌液，摇晃均匀并将浓度调至 OD600=1.0。
采用剪叶法进行接种鉴定，于水稻的分蘖期对需要鉴定的材料进行剪叶接种。将可用于直接接种的适宜浓度菌液置于大号离心管（50mL）中，用剪刀蘸取菌液后剪掉叶尖 1-3cm，每株接种3-5 片完全展开的叶片，避免接种黄叶。接种后两周开始调查，具体根据发病情况而定。本研究采用评估每个叶片的病斑面积（病斑长度占叶片总长度的百分比）或量取病斑长度来衡量发病情况的方法对植株抗感情况进行评价，调查时每个植株量取 3 个叶片。
2.2.2 Indel 引物设计
通过初步检测得到在亲本间具有多态性的分子标记的筛选情况，判断抗病基因在全基因组 12条染色体的定位情况。进一步开发新的 Indel 分子标记，根据本实验室测序得到的水稻品种 JG30的序列和已公布的日本晴（Nipponbare，Nip）基因组序列为参考，根据基因差异序列区域（插入或缺失），通过 NCBI 进行 BLAST 序列比对分析，避免存在水稻其它染色体片段具有同源性较高的序列，使用 Primer3.0 设计特异性引物。扩增得到的 PCR 产物在 5 %的琼脂糖凝胶中进行电泳分离，120 V 下电泳约 40 分钟，电泳完成后取出凝胶，经溴化乙锭（EB）染色，紫外灯下扫描拍照并进行后续的观察分析。
图 2-1 在分蘖盛期野生型 JG30 和突变体 x349 对 31 个白叶枯病菌代表菌系的抗性反应
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第三章 两个水稻类病斑早衰突变体的图位克隆...................................21
3.1 实验材料......................................21
3.1.1 水稻材料.........................................21
3.1.2 主要试剂.................................21
第四章 结论.....................................36
第三章 两个水稻类病斑早衰突变体的图位克隆
3.1 实验材料
3.1.1 水稻材料
类病斑早衰突变体 msl-1、msl-2 是以籼稻品种 JG30 为背景经 EMS 化学诱变剂诱变获得，经过多代连续自交在其后代中挑选出的表型稳定的突变体株系。粳稻品种 02428 由本实验室保存。实验材料分别种植于作物科学研究所网室以及北京顺义实验基地，常规管理。
3.1.2 主要试剂
主要用于分子生物学研究的试剂及试剂盒，包括 PCR 扩增所用的 Mix 和 DNA Polymerase 均购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司；DNA 胶回收试剂盒购自生工生物工程（上海）股份有限公司；RNA 提取试剂 RNAiso Plus 购自宝日医（Takara）生物技术有限公司，cDNA 反转录试剂盒购自天根生化科技有限公司，用于 qPCR 反应的 SYBR® Premix ExTaqTM II 试剂盒购自宝日医（Takara）生物技术有限公司；用于定位的 PCR 相关引物和 qPCR 引物均由均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
主要的生理生化研究的试剂及试剂盒，包括用于组织化学分析的台盼蓝染液购自北京索莱宝（Solarbio）科技有限公司，DAB 显色剂为 Sigma 公司产品；测定总超氧化物歧化酶（T-SOD）、丙二醛（MDA）、过氧化氢（H2O2）、过氧化氢酶（CAT）含量的所有试剂盒均购于南京建成生物工程研究所。另外常规化学试剂均为国产分析纯，产自北京化工厂。RNA 提取和反转录所用RNase-
