本文是一篇农业论文研究，本研究以东北红豆杉为原料，进行愈伤组织的诱导，高产细胞株系的筛选，通过研究细胞分泌促释放剂对细胞膜及紫杉醇产量的影响，建立了促释放剂与调节因子的协同作用高效生产紫杉醇的技术体系；同时，研究了磁性离子液体作为添加剂辅助超声波萃取紫杉醇技术并进行了优化，建立了紫杉醇高效提取方法；最后通过制备三尖杉宁碱分子印迹聚合物，优化其合成条件，为有效分离紫杉醇及其类似物奠定了基础。
第 1 章 绪论
1.1 研究背景与意义
1.1.1 研究背景
肿瘤是一类严重威胁人们生命健康的重大疾病，且每年的癌症病发率和死于癌症的病人均成逐年上升的趋势[1,2]。紫杉醇是世界医药史上开发最成功的一只植物抗癌药产品[3,4]。与此同时，近年来在寻找抗癌生物资源及其天然产物方面也获得了很大成功，尤其是红豆杉中——紫杉醇及其衍生物的发现，使得此项工作取得了突破性进展[5,6]。目前，研究人员已经从红豆杉属植物中分离出 200 多种紫杉类化合物，其中主要的化学成分有紫杉醇、三尖杉宁碱、巴卡亭Ⅲ(BaccatinⅢ)、7-木糖-10-去乙酰基紫杉醇(7-xylosyl-10-deacetytaxol)等[7]。
天然的紫杉烷类化合物仅仅存在于红豆杉属植物中，红豆杉别名紫杉、赤柏松等，为常绿针叶乔木或灌木，美观且古朴的树形，使其不仅具有园艺观赏价值，还可以用作珍贵的家具用材，用途十分广泛[8]。红豆杉属植物分布于北半球温带至中亚热带地区，目前在全世界范围内红豆杉共有 11 个品种，我国有四种，占全球储量的一半以上，分别为曼地亚红豆杉(Taxus madia Rehd.)、中国红豆杉(Taxus chinensis （Pilger） Rehd.)、云南红豆杉(Taxus yunnanensis Cheng et L. K.Fu)、西藏红豆杉(Taxus wallichiana Zucc)、东北红豆杉(Taxus cuspidata Sieb. EtZucc)以及南方红豆杉(Taxus chinensis var. mairei （Lemee et Levl.） Chenget L. K.Fu)[9,10]。紫杉醇是从红豆杉的树皮、树根及枝叶中提取分离出来的一种植物次生代谢产物，是唯一能够促进微管聚合和稳定己聚合微管的抗癌药物[11]。因为，紫杉醇在治疗癌症方面的确切疗效与独特的抗癌机理，使得红豆杉日益受到研究人员关注[12,13]。
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1.2 国内外研究现状
1.2.1 细胞培养法生产紫杉醇的研究进展
为了建立高效生产紫杉醇的细胞悬浮培养体系，不仅需要以坚实的植物生物化学知识为基础，不断地优化细胞培养体系的各个环节，还需要结合前辈的研究经验与所得结论。再利用现代生物学的手段对紫杉醇的合成过程进行探索，从次生代谢水平上促进紫杉醇的合成[124]。本文将从东北红豆杉愈伤组织的诱导以及细胞悬浮培养生产紫杉醇两个方面，论述细胞培养法提高紫杉醇产量的方法，见图 1.2，并对细胞分泌促进剂对紫杉醇的积累和释放行为影响的研究进展做详细的阐述，以期全面地了解如何提高紫杉醇产量，并仔细研究细胞分泌促进剂在红豆杉细胞悬浮培养生产紫杉醇的过程中起到的作用。
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第 2 章 细胞分泌促进剂对红豆杉悬浮细胞生产紫杉醇的影响
2.1 引言
紫杉醇生物合成代谢调控技术是实现细胞培养生产紫杉醇的关键技术。建立有效的代谢调控方法不仅能使实际培养过程中细胞生长和紫杉醇合成稳定可控，而且是实现植物细胞培养生产紫杉醇的前提。紫杉醇作为红豆杉细胞次级代谢的产物，在胞内大量积累势必会造成反馈抑制作用，而且会对细胞产生毒害作用。因此在培养基内添加适量的促释放剂改变细胞膜通透性，使紫杉醇释放到胞外来消除这种反馈抑制作用，同时促进次生代谢的合成，亦是一种提高紫杉醇产量的有效方法。
本章分别选取了四种代表着不同类型的细胞促释放剂，分别为 DMSO、氯化镁、Tween-80 及甘露醇。其中，DMSO 是一种促进真核细胞渗透的有机溶剂，可使细胞膜中的磷脂和固醇小部分丢失，因而导致一些特殊的膜蛋白聚集起来形成了新的膜通道，细胞膜通透性变大。氯化镁作为无机盐的代表，加入到悬浮培养液中，可以改变细胞的渗透压，增加通透性，提高紫杉醇的释放率。而表面活性剂 Tween-80 因具有规则且微小的胶团结构，且其疏水部分能代替细胞膜磷脂双分子层的尾部脂链，形成新的通道，从而改变细胞膜通透性。甘露醇的添加使得培养基的渗透压增大，当东北红豆杉细胞受到这种胁迫时，会导致细胞膜的通透性增加。因此，探究细胞分泌促释放剂种类及其最优的浓度范围有助于刺激红豆杉细胞，增大细胞膜的通透性，使得紫杉醇更容易释放到培养基中。
本实验首先进行东北红豆杉愈伤组织的诱导并建立高产东北红豆杉悬浮细胞系。然后为探究四种细胞促释放剂对红豆杉细胞生长和紫杉醇产量的影响，分别进行单因素试验。再根据实验结果，选取四种促释放剂的最优浓度范围继续进行单因素试验来分别考察细胞质膜相对通透性、丙二醛含量、细胞相对生长速率及紫杉醇含量和释放率等指标随时间的变化情况，以此反映出细胞分泌促释放剂对细胞膜通透性以及紫杉醇产量的影响。最后通过对实验所得数据的进行分析，得到能够同时兼顾细胞生长与紫杉醇产量的最佳细胞分泌促进剂的种类和浓度，为后续试验的开展奠定了基础。
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2.2 材料与方法
2.2.1 材料与仪器
试验材料：吉林大学农学实验园内种植的 10 年生东北红豆杉当年生的幼茎。主要试剂及主要仪器：如表 2.1 和表 2.2 所示。
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第 3 章 东北红豆杉悬浮细胞代谢与释放紫杉醇优化试验..............35
3.1 引言................................35
3.2 材料与方法.........................35
第 4 章 磁性离子液体辅助超声波提取紫杉醇工艺优化试验.........49
4.1 引言...............................49
4.2 材料与方法.........................49
第 5 章 利用分子印迹技术分离提纯紫杉醇结构类似物的研究.... 63
5.1 引言.................................63
5.2 材料与方法......................64
第 5 章 利用分子印迹技术分离提纯紫杉醇结构类似物的研究
5.1 引言
分子固相萃取技术对目标分子不仅具有良好的选择性和亲和性，而且较传统分离技术更加快捷简便，且可反复使用。近年来，利用分析印迹技术萃取紫杉醇的实验研究也一直在如火如荼的展开。2016 年，闫艳等人[100]以紫杉醇为模板，MAA 为功能单体、丙酮为致孔剂、EDGMA 为交联剂，合成了紫杉醇的分子印迹聚合物，并通过实验得出三者的最佳比例为 1:6:30，再以该印迹聚合物为固相萃取柱，对发酵液中的紫杉醇进行萃取研究，实验结果说明了分子印迹技术能够高效、专一性的富集紫杉醇。2017 年，王可兴等人同样利用该技术，合成紫杉醇分子印迹聚合物，并以此为填料进行固相萃取，分离纯化紫杉醇，实验结果表明：功能单体(MAA)与紫杉醇的最佳摩尔比为 4:1，聚合温度为 60℃时，聚合效果最佳，并且符合 Scatchard 模型，最大表观结合点数为 3.66mg·g-1，Kd 为 6.627。
从以上实验结果不难看出，分子印迹技术能够为紫杉醇的分离和纯化提供一种新的思路，并且相应的分子印迹聚合物可以作为新型选择性的富集材料。众所周知，紫杉醇在红豆杉属植物中的含量很低，而且，红豆杉属植物中还存在着很多紫杉烷类物质。由于这些物质往往与紫杉醇的结构相似，因此，在分离紫杉醇时经常一起被分离出来，影响紫杉醇的提取效率与纯度。而其中最为难分离的便是三尖杉宁碱，虽然以其为前体以及修饰的起始原料来合成紫杉醇，可以有效解决紫杉醇资源不足的问题，但是由于其与紫杉醇结构非常相似，分离纯化难度大，所以往往不能为一般工艺提取出来。由此可见，利用分子印迹技术这种具有高识别性、实用性的提取纯化方法来有效分离三尖杉宁碱具有研究和现实意义。
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第 6 章 结论与展望
6.1 结论
本研究以东北红豆杉为原料，进行愈伤组织的诱导，高产细胞株系的筛选，通过研究细胞分泌促释放剂对细胞膜及紫杉醇产量的影响，建立了促释放剂与调节因子的协同作用高效生产紫杉醇的技术体系；同时，研究了磁性离子液体作为添加剂辅助超声波萃取紫杉醇技术并进行了优化，建立了紫杉醇高效提取方法；最后通过制备三尖杉宁碱分子印迹聚合物，优化其合成条件，为有效分离紫杉醇及其类似物奠定了基础。本文主要结论如下：
（1）通过对研究四种细胞分泌促释放剂对悬浮培养的红豆杉细胞的影响，发现既能兼顾紫杉醇的有效释放又可以对细胞生长造成较小影响的最佳浓度分别为：DMSO（4%）、Tween-80（300μg·g-1）、氯化镁（12mmol·L-1）和甘露醇（300mmol·L-1），并且在第 15 天时，其紫杉醇总含量分别为 8.40、6.5、5.3 和5.2 ㎎/L，渗透率为 74%、44%、33%和 41%。
（2）通过磁性离子液体作添加剂辅助超声波提取紫杉醇的研究，得到：添加四种磁性离子液体均能够有效地提高紫杉醇萃取率，但双咪唑磁性离子液体效果更好，其中｛C4(Mim)2｝Fe Cl3/Br2 为溶剂添加剂时，紫杉醇的提取量
