本文是一篇农业硕士论文,本研究表明,布氏田鼠下丘脑内繁殖相关基因的分布特点与其他研究报道结果大体一致,但细节上也有所不同。这可能主要有如下两点原因:一是目前没有布氏田鼠的专用脑区图谱,本研究参照的是小鼠脑图谱,两者间可能存在一定的种间差异,这可能导致所取脑区有所误差,从而影响结果精度。二是这些脑区相互之间紧密相连,界限并不明显,例如,AVPV 区、ARC 区、DMH区与 3V 区紧密相连,DMH 区与 ARC 区相邻等,在分离时难免互相粘连,这可能对结果的准确性也有一定影响。目前,最准确进行脑区分离的方式是激光显微切割技术(laser capture),其主要方法是利用染料对大脑切片进行染色区分脑区后,在倒置显微镜下进行判断、激光切割和取样,可更加准确的判断和分离单个(MORO et al., 2019)。另外,在下一步研究中,需要建立布氏田鼠的下丘脑区脑图谱,以指导细化研究,并应探索使用原位杂交技术对特定基因表达位置进行深入研究。
第一章 绪论
1.1 鼠的危害及繁殖特点
鼠害是一种重要的生物灾害,在人类生产生活的各个方面均造成严重危害。在农业上,我国每年农田鼠害发生面积约 4000 万 hm2,损害的粮食超过 100 亿 kg;在林业上,害鼠啃食树幼苗、树根、树皮和植物种子,导致森林更新变缓、树木死亡,进而影响森林绿化和植物固沙;在草原上,害鼠啃食牧草根系、取食种子,导致草场植被退化,沙化加剧,影响草原畜牧业的发展(施大钊 等,2008)。此外,鼠类是许多病毒、细菌和寄生虫的宿主,可以传播 50 多种人畜共患病,其中不乏鼠疫、出血热等烈性疾病,严重危害人类健康。因此,鼠害治理对于经济发展和社会稳定具有非常重要的意义。
鼠类易于暴发成灾的重要原因之一是其具有强大的繁殖能力,繁殖周期短、胎仔数高、性成熟快。以褐家鼠(Rattus norvegicus)为例,孕期约为 21 天,平均胎仔数约为 6.5 只,性成熟时间5 周左右,而且具有产后动情的特点;据模型估算,按 3 个月传 1 代计算,1 对褐家鼠及其子代的数量在 1 年内可达 15552 只(曾粤宗,2003)。因此,提高害鼠的死亡率和降低其繁殖力,是控制鼠害发生的两种主要指导思路。
在自然界,季节性繁殖现象是包括鼠类在内的许多哺乳动物共同的繁殖特点,尤其是非繁殖性腺功能下降被称为“天然不育模型”(LINCOLN et al., 1980)。但是,季节性繁殖的表现非常复杂,即使在同属或同种动物间都具有较高的可塑性。例如,白足鼠属(Peromyscus)的一些种类在北纬 60o的地区每年只有 2-3 个月的繁殖期,而在北纬 45o的地区每年有 5-7 个月的繁殖期,在北纬度 30o-45o的地区则表现出季节性和非季节性混合的繁殖策略,而低于北纬 30o的地区则可以全年繁殖(BRONSON, 1988)。因此,鼠类的季节性繁殖机制是多种环境因素对其神经内分泌共同作用的结果,解析鼠类繁殖调控机制有助于了解鼠类发生规律,以之为模型有望解析鼠类繁殖调控中的关键基因及通路,为防控鼠害提供新思路。
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1.2 鼠类繁殖的季节性
1.2.1 鼠类的季节性繁殖现象
大多数温带和北方地区的动物采用季节性繁殖策略,将繁殖活动集中在每年的特定时期,以适应高度变化的外界环境,保证后代较高的存活率(HAZLERIGG et al., 2015)。季节性繁殖动物最明显的特征是繁殖器官活性呈现出显著的年度周期性变化:在繁殖期,动物性腺处于活跃状态,第二性征明显、繁殖器官膨大、性激素水平升高、出现繁殖育幼行为;在非繁殖期,动物处于繁殖抑制状态,其性腺萎缩、性激素水平降低、性行为消失。有关啮齿动物季节性繁殖的研究有很多。小家鼠(Mus musculus)作为较早期研究季节性繁殖的主要对象,具有较高的繁殖率和快速生长发育的能力,调查发现当它处于温带地区时进行季节性繁殖,而在环境条件允许的情况下可以全年繁殖(BOMFORD, 1987)。因此,环境条件的变化在调控动物繁殖策略中起重要作用,例如,野生金色中仓鼠(Mesocricetus auratus)在夏季末性腺开始萎缩,当日照时长缩短至 12.5 小时以下,意味着繁殖期的结束,在冬季末日照时长增加至 12.5 小时以上时,繁殖期开始,确保动物繁殖周期的连贯性(ELLIOTT et al., 1981)。这一现象在其他鼠种中也有发现,野生雄性黑线毛足鼠(Phodopus sungorus)的睾丸发育在春夏季被显著刺激,在秋冬季被显著抑制(HOFFMANN, 1979),说明日照时长的变化在调控动物繁殖活动中起重要作用。
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第二章 材料与方法
2.1 实验设计
2.1.1 实验动物
本实验动物亲本来源于内蒙古锡林郭勒典型草原区的野生布氏田鼠种群,在实验室已经历饲养繁殖 10 年以上。实验选用健康的个体,以锯末和刨花为垫料,饲养于自然光照下(北京),温度为 20±2℃,水、饲料(北京市房山希望饲料有限责任公司)供应充足。
2.1.2 实验一:下丘脑基因表达的脑区空间分布特征
将出生并饲养于长光照中 6 周、8 周和 11 周龄的雄性布氏田鼠处死后取全脑,置于干冰速冻,保存于-80℃下直至切片。切片时,将全脑样本固定在冷冻切片机上,刀头温度选择-12℃,切片厚度为 120μm,切好的脑片固定于载玻片上。脑区识别参考小鼠脑图谱(FRANKLIN et al., 1997),分辨 AVPV 区、DMH 区、3V 区、ARC 区的具体位置(图 2-1)。用灭菌后的刀片分离特定脑区,分离的脑区样本放置在 1.5mL 的离心管,保存在-80℃至 RNA 提取。
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2.2 实验材料
2.2.1 主要试剂
(1)共提取试剂盒:DNA/RNA Mini Kit(QIAGEN 公司)
(2)RNA 提取试剂盒:Direct-zol RNA Miniprep(ZYMO Research 公司)
(3)反转录试剂:TransScript One-Step Gdna Removal and cDNA Synthesis SuperMix(TransGen Biotech 公司)
(4)荧光定量试剂:Power SYBR? Green PCR Master Mix(Applied biosystems 公司)
(5)重亚硫酸盐测序:EZ DNA Methylation-Gold Kit TM(ZYMO Research 公司)
(6)PCR 扩增试剂:EpiTaqTMHS(for bisulfite-treated DNA)(Takara 公司)
(7)克隆试剂:T4 DNA 连接酶(Promega 公司),T-Vector pMD19(Simple)载体、DNA 限制性内切酶、DNA marker(Takara 公司)
(8)PCR 检测试剂:琼脂糖(Bioweste Agaroes)、核酸染料 GelStain(全式金公司)、DNA marker(Takara 公司)
(9)褪黑素注射试剂:Melatonin(Sigma 公司)
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第三章 实验结果与分析 ........................... 19
3.1 雄性布氏田鼠下丘脑季节繁殖调控相关基因的各脑区表达特征 ...................... 19
3.2 褪黑素注射对雄鼠性腺发育和下丘脑繁殖相关基因表达的影响 ...................... 22
第四章 讨论 ................................. 33
4.1 布氏田鼠下丘脑繁殖相关基因在脑区间的分布特征 .................... 33
4.2 褪黑素对布氏田鼠性腺发育抑制的分子机制 ....................... 34
第三章 实验结果与分析
3.1 雄性布氏田鼠下丘脑季节繁殖调控相关基因的各脑区表达特征
为研究季节繁殖相关基因 Dio2、Dio3、Rfrp-3、Kiss-1 和 GnRH 在雄性布氏田鼠下丘脑中的分布特点,在 6 周龄、8 周龄和 11 周龄对正常发育的雄性布氏田鼠下丘脑脑区进行分离,以皮层作为对照,测定这些基因在下丘脑中的分布特征及年龄变化。
Dio2 基因:在各时间点中,Dio2 基因均在皮层中表达量最高,显著高于下丘脑各脑区。在下丘脑中 Dio2 基因表达在 6 周龄时总体差异显著(P=0.001),在 ARC 区最高,分别达到显著高于AVPV 区(P=0.020,2.56 倍)、3V 区(P=0.046,2.05 倍)和 DMH 区(P=0.048,2.03);而在 8周龄(P=0.069)和 11 周龄(P=0.055)表达分布比较均匀,各脑区间 Dio2 基因相对表达量无显著差异(见图 3-1)。
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第四章 讨论
4.1 布氏田鼠下丘脑繁殖相关基因在脑区间的分布特征
之前的研究主要利用半定量原位杂交技术对 Dio2、Dio3、Kiss-1、Rfrp-3、GnRH 等这些下丘脑内光周期和繁殖相关基因的表达进行检测,其优点是可以比较精确