甲胺磷人工抗原合成和单克隆抗体制备研究

甲胺磷人工抗原合成和单克隆抗体制备研究 甲胺磷 (Methamidophos, Met) 是一种高效剧毒的有机磷农药，由于违禁使用于果、蔬、茶等作物或不按规定使用而导致中毒的事件屡有发生，很有必要加强安全监测工作。甲胺磷残留最常用的检测方法为仪器分析法，由于需要复杂昂贵的仪器，仅适合于一些装备比较好的实验室使用。免疫分析方法由于具有简便、快速和特异性，且能适于现场测定，近年来，备受重视。为了建立免疫分析方法，首先必须制备效价高特异性强的抗体。甲胺磷的分子量只有141，本身没有免疫原性，必须将其与载体蛋白质偶联制备人工抗原后，才能免疫小鼠产生抗体。 以纯品甲胺磷分子为原料分别用碳二亚胺 (EDC) 法和戊二醛 (G) 法与牛血清蛋白质 (BSA) 和卵清蛋白质 (OVA) 反应制备人工抗原BEM和OGM；以生产甲胺磷的活泼前体物O，S-二甲基硫代磷酰氯（MetCl）与赖氨酸 (L) 反应合成中间体O, S-二甲基硫代磷酰化赖氨酸，再以EDC 法使中间体O, S-二甲基硫代磷酰化赖氨酸与载体牛血清蛋白质交联制备人工免疫抗原BLM；同时用O, S-二甲基硫代磷酰氯 (MetCl) 与卵清蛋白质和多聚赖氨酸（PLL）反应制备人工包被抗原OVAM和另一个人工免疫抗原PLLM。上述所有合成的人工抗原经冷冻干燥后-20℃保存。 用5种方法对上述合成的人工抗原进行鉴定，结果表明： ① SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法 人工抗原BEM、OGM迁移距离和原载体BSA、OVA相同，而人工抗原BLM、OVAM、PLLM的迁移距离分别比原载体BSA、OVA、PLL小。 ② 红外光谱法 人工抗原BEM、OGM的红外光谱图与原载体BSA、OVA相同；而人工抗原BLM、OVAM、PLLM的红外光谱图中出现与甲胺磷分子完全相似的P-O-C和P=O双键的特征吸收。 ③ 紫外光谱法 人工抗原BEM的紫外光谱图与原载体BSA相同；人工抗原OGM的最大紫外吸收峰位置与原载体OVA相比发生变化，但与对照OG (OVA与戊二醛反应的产物) 最大紫外吸收峰的位置相同；人工抗原BLM、OVAM、PLLM的最大紫外吸收峰的位置与各自原载体BSA、OVA、PLL及半抗原Met相比均发生变化，3种人工抗原最大紫外吸收峰的位置明显向远紫外区偏移。 ④ 31P NMR谱法 人工抗原BLM、OVAM、PLLM的31P NMR谱中出现与标准甲胺磷一致的化学位移峰，表明这3种人工抗原上具有甲胺磷分子的结构；而当测定人工抗原BEM、OGM 的31P NMR 谱时，却没有磷信号出现。 ⑤ 钼锑抗比色法 钼锑抗比色法测定人工抗原中磷浓度并计算出人工抗原BLM和OVAM的偶联比分别为11和13，PLLM的偶联比为8～19，而BEM 和 OGM 的偶联比为0。 上述5种鉴定方法综合说明人工抗原BEM和OGM合成不成功，而人工抗原BLM、OVAM和PLLM合成成功。 用合成的人工抗原PLLM免疫Balb/c小鼠，第8次免疫后的第10d，小鼠尾部取血制备抗血清。抗血清间接ELISA分析表明：1∶50倍比稀释的抗血清与2μg/mL PLL包被的酶标ELISA反应没有颜色出现，说明抗血清内没有产生针对载体的抗体。抗血清与用同浓度PLLM、OVAM、PLL和OVA包被的酶标板反应后，其中PLLM的OD492nm吸光值比PLL大50%，OVAM的OD492nm吸光值比OVA大20%以上，初步说明抗血清中产生了抗甲胺磷的抗体。3只小鼠抗血清的间接竞争ELISA 的492nm处吸光值都比相应非竞争的间接ELISA的读数明显小，说明甲胺磷能与抗血清内的抗体竞争性地结合，从而更证明小鼠血清内均产生了抗甲胺磷的抗体。但抗体效价只有1:400，不宜用于细胞融合制备单克隆抗体。 用人工抗原BLM免疫小鼠共4次后，4只小鼠均产生了抗甲胺磷的抗体，其中B1小鼠产生的抗体效价最高，达到6400，拟用于细胞融合制备单克隆抗体。用B1小鼠的血清进行ELISA最佳条件研究，得出最佳反应条件：酶标二抗稀释倍数为1:3000；竞争时间为1h；包被抗原浓度为OVAM 2μg/mL。 用50% PEG将B1小鼠的脾细胞与SP2/0瘤细胞进行融合，经多次筛选和克隆得到2株阳性杂交瘤细胞，2株细胞培养的上清液与载体OVA、BSA包被的酶标板反应成阴性，与OVAM包被的酶标板反应呈阳性，间接竞争ELISA表明甲胺磷能与2株细胞上清液内的抗体进行特异性结合，因此，该2株细胞是我们期望的产甲胺磷的单克隆细胞株，分别命名为1C3和2C6。ELISA检测结果表明：两株产甲胺磷单克隆抗体的细胞都属于IgG1亚类。 用培养扩增后的1C3细胞诱导小鼠生长腹水，其中腹水的效价为1:25600。并用SPA亲合层析和辛酸-硫酸铵沉淀方法纯化腹水抗体，SPA亲合层析后能得到很纯的小鼠IgG抗体，凝胶电泳仅显示IgG的重链和轻链2条带；而辛酸-硫酸铵沉淀纯化后的抗体电泳图中除显示IgG的重链和轻链2条带外还显示出一条杂质蛋白质带。两种方法纯化后抗体的工作浓度为0.06μg/μL。SPA纯化后的抗体对甲胺磷的IC50值为181.26μg/mL，用该抗体检测甲胺磷的检测范围为：8.43～3896.01μg/mL，最低检测限：3.03μg/mL。辛酸-硫酸铵沉淀方法纯化后抗体对甲胺磷的IC50为352.82μg/mL，用该抗体检测甲胺磷的检测范围为：10.91～11412.29μg/mL，最低检测限：3.42μg/mL。SPA纯化后的抗体与农药乙酰甲胺磷稍有交叉反应（1.17%）、与农药敌敌畏和乐果几乎没有交叉反应。 1C3细胞分泌的单克隆抗体经SPA亲合层析纯化后可以用于金标免疫试纸或酶联免疫试剂盒的制备。 关键词：甲胺磷 人工抗原 合成 鉴定 单克隆抗体