本文是一篇医药学论文，本论文提出了两种高灵敏的分析新方法，即化学发光免疫分析新方法和荧光分析新方法，分别应用于前列腺特异抗原（Prostate specific antigen, PSA）和阿仑膦酸钠（Alendronate sodium, ALDS）的检测。
1 绪论
1.1 人工模拟酶的概述
酶（Enzyme）是一种强大的生物催化剂[1]，其主要由蛋白质组成，少数是RNA分子，且控制着许多催化生理过程，如新陈代谢、营养、能量转换和疾病等，从而加速了生命赖以存在的各种反应[2, 3]。此外，按照催化的反应类型，天然酶可以分为氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂合酶、异构酶、连接酶和转位酶等七个大类，具有催化效率高、底物专一、反应条件温和等特点，因而被广泛应用于临床诊断、制药工程、食品工业和环境保护等多种领域[4]。然而，天然酶具有制备和纯化的成本高、操作稳定性低、对环境条件敏感以及回收和再利用困难等劣势，难以满足现代工业的需求[5]。因此，研究者们致力于寻找既具有天然酶的催化活性又能克服天然酶不足的替代品，这种替代品叫做人工模拟酶，其主要包含了两条模拟途径：一是模拟酶活性中心的功能团；二是模拟酶的作用方式。1970年Breslow团队首次合成了第一个传统模拟酶-环糊精金属配合物，其具有羧肽酶的催化活性，由此掀起了人工模拟酶的浪潮[6]。迄今为止，科学家已陆续设计和合成了一系列稳定性好且易于制备的人工模拟酶，主要包括传统模拟酶和新型模拟酶（即纳米酶，Nanozyme）两大类（其主要发展历程如图1.1），并将它们广泛应用于生物、医药、化工、环境等领域[7]。
1.2 类ALP传统模拟酶的研究进展
自上世纪50年代中期，研究者们开始模拟水解酶，最初主要模拟水解酶的催化中心，其后发展到对水解酶催化中心和结合中心的综合模拟，现在的研究主要集中在对其催化中心协同作用的模拟[28-31]。遵循以上的思路，在设计和合成类ALP传统模拟酶方面，研究者们先后提出了金属离子模拟酶、金属配合物模拟酶、杯芳烃模拟酶、聚合物模拟酶、金属胶束模拟酶和超分子模拟酶等模型，针对这些模型的探索也取得了很大的进展。现将近年来类ALP传统模拟酶的研究进展综述如下。
1.2.1 金属离子模拟酶
金属离子是一种典型的“路易斯酸”，作为许多水解酶的催化中心，对催化过程中的各个基团的移动具有很好的定向作用[32]。因此，对金属离子模型体系的研究有助于理解磷酸单酯水解等反应中金属离子的作用。近年来，已报道了Zr(Ⅳ)[33, 34]和Ce(Ⅳ)[35]具有类ALP催化活性。
例如，胡连哲课题组以4-甲基伞形酮磷酸盐（4-Methylumbelliferone phosphate, 4-MUP）为底物，评估了Zr(Ⅳ)具有类ALP催化活性[33]。随后，他们发现Ce(IV)可以催化磷酸酶底物2-氯-5-（4-甲氧基螺[1，2-二氧杂环丁烷-3，2′-（5-氯三环[3.3.1.13.7]癸烷]）-4-基]-1-苯基磷酸二钠（CDP-Star）的水解，产生强的化学发光（Chemiluminescence, CL）发射。添加离子液体1-丁基-3-甲基咪唑鎓四氟硼酸盐（[BMIM][BF4]）后，Ce(IV)/CDP-Star体系的CL性能得到显著改善。在此基础上，实现了对Ce(IV)高选择性和高灵敏的CL检测，检测限（Limit of detection, LOD）为0.46 μM。基于Ce(IV)能催化CDP-Star水解而Ce(III)不能催化的现象以及Ce(IV)与Ce(III)可通过氧化还原反应进行相互转换的性质，该CL体系也被用于检测氧化性和还原性物质，比如抗坏血酸和次氯酸根，即在Ce(IV)/CDP-Star的混合物中引入还原性物质抗坏血酸可降低CL信号，而在Ce(III)/CDP-Star的溶液中添加氧化性物质次氯酸根可增强CL信号。最后，Ce(IV)/CDP-Star体系的CL成功应用于评估商业果汁样品的总抗氧化能力[35]。
2 基于类碱性磷酸酶纳米酶标和离子液体辅助的化学发光免疫分析新方法及其在前列腺特异抗原检测中的应用
2.1 引言
前列腺癌是男性高死亡率的常见非皮肤癌，仅前列腺分泌的前列腺特异抗原（Prostate specific antigen, PSA）是诊断前列腺癌的可靠生物标志物[111]。尽早地且超高灵敏地评估PSA的水平可以增加成功治疗的机会，从而降低死亡率[112, 113]。此外，前列腺切除术治疗的术后患者可能会遭遇复发，这常伴随着PSA水平的反弹[114, 115]。因此，PSA的超灵敏定量对于尽早地诊断和预测前列腺癌的复发至关重要。
酶联免疫吸附试验（Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）被认为是最广泛使用的高选择性PSA定量方法之一[116]。对于传统ELISA，辣根过氧化物酶（Horseradish peroxidase, HRP）和碱性磷酸酶（Alkaline phosphatase, ALP）是最常用的两种酶标记，具有良好的稳定性和高催化活性[22, 117, 118]。与HRP相比，ALP作为酶标记物具有较高的底物稳定性，因此可以提供较低的背景[119]，此外，基于ALP的ELISA不需要H2O2作为共底物，可以避免氧化还原性物质引起的干扰[120-122]。但是，天然酶自身具有狭窄的嗜热范围、较短的保存期限和容易失活的缺点，进而严重影响了HRP和ALP在商业ELISA中的使用[9, 123, 124]。这些缺点可能会限制其在商业免疫分析中的应用。
近年来，被定义为“具有酶样特性的纳米材料”的纳米酶被认为是天然酶的低成本且高度稳定的替代品[125]。各种类型的纳米酶如类氧化酶（Oxidase, OXD）纳米酶、类过氧化物酶（Peroxidase, POD）纳米酶和类ALP纳米酶等[10, 126]已被报道。迄今为止，纳米酶已被广泛应用于生物传感、生物医学和环境保护等多种领域[127-131]。其中，具有类HRP活性的纳米酶已被用于抗体标记，以建立比色或荧光免疫分析方法[77, 132, 133]。然而，尽管已经证明了CeO2纳米粒子（Nanoparticles, NPs）、ZrO2 NPs、金属-有机骨架（Metal-organic frameworks, MOFs）和纳米多肽具有类ALP催化活性[33, 80]，但类ALP纳米酶在免疫测定中的应用研究尚未见报道。
2.2 实验部分
2.2.1 主要仪器与试剂
2.2.2 PAA-CeO2的制备
PAA-CeO2是在PAA存在下使用氢氧化铵作为沉淀剂通过沉淀法合成的[83]。简而言之，首先，将0.54 g六水硝酸铈（III）和0.05 g PAA完全溶解在1.25 mL去离子水中。然后，将所得混合物引入7.5 mL氢氧化铵中。其次，在室温下连续搅拌1天后，将悬浮液以5,000 rpm离心5分钟，用去离子水清洗三次。最后，将沉淀的PAA-CeO2重新分散在10 mL去离子水中以备进一步使用。
3 基于类碱性磷酸酶纳米酶绿色锆基金属-有机骨架的荧光分析新方法及其在阿仑膦酸钠检测中的应用 ............... 45
3.1 引言 .................................... 45
3.2 实验部分 .......................................... 47
4 总结与展望 .................................... 61
4.1 总结 .............................................. 61
4.2 展望 ........................................... 61
3 基于类碱性磷酸酶纳米酶绿色锆基金属-有机骨架的荧光分析新方法及其在阿仑膦酸钠检测中的应用
3.1 引言
双膦酸盐是焦磷酸盐的合成类似物，可防止主要骨矿物质羟基磷灰石的溶解，从而阻止骨质流失。阿仑膦酸钠（Alendronate sodium, ALDS）是具有P-C-P化学结构的第三代双膦酸盐类药物，可用于治疗各种骨骼疾病，如骨质疏松症、佩吉特病以及恶性肿瘤的低钙血症[148, 149]。ALDS具有高亲水性和强极性，不易穿过细胞膜，口服吸收效率极低。然而，高剂量的ALDS会刺激上消化道产生副作用，而且ALDS对软组织具有毒性[149-151]。迄今为止，为了检测人体体液和相关药物中的ALDS，已报道了多种检测技术，包括色谱[151]、电化学方法[152]、毛细管电泳[153]及分光光度法[154, 155]等，但这些方法大多具有反应时间长、衍生化的成本高、操作程序复杂等缺点。因此，有必要设计一种灵敏、方便和低成本的ALDS检测新方法。
纳米酶因其易于合成、稳定性好和成本低等优点而受到广泛关注，但与天然酶相比，纳米酶具有催化活性低和选择性较差的问题。因此，迫切需求开发新型高性能的纳米酶。目前，开发新型高性能纳米酶的方法主要集中在两个方面：第一，直接筛选纳米材料，对其改变尺寸[10, 77, 156, 157]和形貌[17, 158, 159]、表面修饰[160-162]、掺杂[163]及杂化或形成络合物等[164]；第二，通过模拟天然酶活性中心的组成和几何结构，仿生设计新型高性能纳米酶[165, 166]，特别是催化高度依赖天然酶空间结构的非还原氧化酶类纳米酶的设计[167]，如水解酶类（包括磷酸酶、脲酶等）。对于类ALP纳米酶，CeO2 NPs、ZrO2 NPs、MOFs
