本文是一篇医药学论文，本研究以1,4-环己烷二甲醇(CHDM)为底物，通过醇氧化酶一酶两步法催化1,4-环己烷二甲醇生产1,4-环己烷二甲醛(CHDA)。首先，通过体外转化实验验证了醇氧化酶催化合成CHDA的可行性。
第一章 绪论
1.1 1,4-环己烷二甲醛的简介
1.1.1 1,4-环己烷二甲醛的分子结构和理化性质
1,4-环己烷二甲醛(1,4-cyclohexanedicarboxaldehyde，CHDA)是一种同时具有环己烷和两个醛基的化合物，因而存在船式和椅式两种构象，属于构象异构体。由于两个醛基基团之间存在相互作用，导致椅式构象比船式构象更为稳定，因此CHDA在室温条件下大多以椅式构象存在。结构式如图1-1所示，CHDA结构较为简单，分子式为C8H12O2，相对分子质量为140.18。常温下，CHDA的外观呈无色透明液体，由于其含有疏水性基团醛基而微溶于水，溶解度为3.40 g·L-1。
1.1.2 1,4-环己烷二甲醛的应用
1,4-环己烷二甲醛(CHDA)作为含碳环螺环化合物的初始合成原料，被广泛应用于有机合成、医药、化工和材料等多个领域。
(1) 在医药领域，CHDA是合成1-氨基-烷基环己烷衍生物的前体物质，可用于预防或治疗与耳鸣有关的认知损伤[1]。例如，1-氨基-1,3,3,5,5-五甲基环己烷(Neramexane)可用于治疗各种神经学上的疾病，包括神经性疼痛和阿尔兹海默病等。同时，1,4-环己烷二甲醛(CHDA)还可以作为取代的环己烷-1,4-二胺衍生物的前体物质，取代的环己烷-1,4-二胺衍生物被用于治疗抑郁症、焦虑症、紧张以及与紧张有关的神经性疾病，也可作为促智药物治疗阿尔兹海默症以及与学习和记忆困难相关的一般性认知功能障碍等，除此之外还可作为肌肉松弛剂、抗惊厥剂、利尿或抗尿钠排泄的药物等[2]。与此结构相似的其他物质，如取代的环己烷衍生物，也通过CHDA作为前体物质合成，取代的环己烷衍生物可用于Ⅱ型糖尿病以及与肝脏代谢相关的以葡萄糖6-磷酸酯酶活性增高或葡萄糖释放量增高为特征疾病的药物制备[3]。除此之外，CHDA还可用于反式-1,4-环己烷二异氰酸酯(trans-1,4-cyclohexane diisocyanate, CHDI)的制备，它可作为医药聚氨酯弹性体的前体物质[4]。
1.2 伯醇氧化反应研究进展
1.2.1 化学合成法的研究进展
伯醇氧化反应是有机合成中非常重要的官能团转化反应，在有机化学、生物催化和应用研究领域具有极其重要的地位。它能将醇氧化生成一系列醛类产物，包括脂肪醛、苯醛和烯丙基醛等(表1-1)，是合成精细化学品、药品、香料和食品的基本组成成分[13-15]。催化伯醇氧化的化学试剂主要有三种，分别是传统化学氧化剂、均相催化剂和多相催化剂。传统化学氧化剂包括氧化铬[16]、氧化锰[17]、高价碘[18]、活化的二甲基亚砜(Dimethyl sulfoxide, DMSO)等[19]，但这些化学氧化剂催化伯醇氧化过程中存在原子利用率低、安全系数低、成本高的现象，并伴随大量金属污染物生成，这对反应后处理以及环境都十分不利。同时有些强氧化剂无法将醇选择性的氧化为醛，而是发生过氧化副反应产生羧酸，为后续分离纯化增加了难度；均相催化剂催化伯醇氧化反应主要包括：Cu(Ⅰ)/TEMPO[20]、Cu(Ⅱ)/TEMPO[21]和Cu(Ⅰ, Ⅱ)/TEMPO[22]催化体系。这种类型的催化体系可以在不添加碱的情况下使用空气氧化醇生成相应的醛，但催化剂不能循环使用，导致反应成本较高[23]；多相催化剂包括金属催化剂和非金属催化剂，如金属催化剂Ru、Pd、Au及非金属催化剂SiO2和C3N4等，这些催化剂具有较好的分散性和稳定性，但需要负载在合适的载体上才能可以实现醇的高效催化。另外，金属催化剂的制备依旧十分昂贵，从经济的角度来看，这无疑限制了它的工业化应用，而非金属催化剂可选择性氧化伯醇为羧酸盐或醛，易形成多余的副产物。因此，从工业角度看，这些问题的解决迫在眉睫，而生物催化法具有反应条件温和、操作方便、区域选择性高等优势，因此近年来得到发展，拥有广阔的应用前景。
第二章 材料与方法
2.1 实验材料
2.1.1 菌株和质粒
本实验所用野生型菌株及质粒如表2-1所示：
2.2 分子基本操作
2.2.1 基因组、质粒的提取及产物的回收
(1) 细菌基因组DNA的提取
将购买的菌株按照具体的培养要求进行活化，离心菌体后使用细菌基因组DNA提取试剂盒(天根生化科技股份公司)抽提野生型醇氧化酶、醇脱氢酶和漆酶菌株的基因组，具体的操作步骤见试剂盒内说明书。
(2) PCR扩增及产物回收
按表2-1所示引物，利用PCR扩增含有醇氧化酶、醇脱氢酶和漆酶的基因片段。按表2-6所示PCR反应体系对目的片段进行扩增。经琼脂糖凝胶电泳对目的条带进行分离并使用胶回收试剂盒对正确片段进行回收纯化，具体的操作步骤见试剂盒说明书。
2.2.2 野生型重组菌株的构建
在PDB数据库中搜索与胆分节杆菌A. cholorphenolicus来源的醇氧化酶蛋白序列相似性较高的蛋白晶体结构，利用SWISS-MODEL在线软件(https://swissmodel.expasy.org/)以获得的序列同源性较高的蛋白晶体结构为模板对A. cholorphenolicus来源的醇氧化酶(AcC O)进行同源建模，并利用可视化软件PyMol对同源建模得到的醇氧化酶(AcC O)三级结构进行分析。
使用PubChem在线网站(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)下载配体CHDM、FHMC和FAD的3D结构，下载得到mol格式的3D结构后通过使用Gauss View软件将其转换成.pdb格式用于分子对接。
利用常用的分子对接软件Auto Dock进行刚性对接。首先根据醇氧化酶的结构特点确定关键活性位点后选择其与配体具体的对接位置；分子对接前将所有配体(CHDM、FHMC和FAD)结构进行去水加氢；利用vina将配体CHDM和FAD或FHMC和FAD分别对接进入AcC O的结合口袋中，从而获得相应的复合物WT-CHDM和WT-FHMC。
第三章 结果与讨论 .................................... 22
3.1 醇氧化酶的筛选与异源表达 ......................... 22
3.1.1 1,4-环己烷二甲醛合成路径的设计 ................................. 22
3.1.2 酶的异源表达及最优菌株的筛选 ....................... 23
主要结论与展望 .................................... 42
主要结论 ..................................... 42
展望 .................................. 43
第三章 结果与讨论
3.1 醇氧化酶的筛选与异源表达
3.1.1 1,4-环己烷二甲醛合成路径的设计
首先对1,4-环己烷二甲醛(1,4-cyclohexanedicarboxaldehyde, CHDA)的化学结构进行了分析，如图3-1所示，它是由两个醛基组成的环己烷类化合物，且两个醛基分别处于1-位和4-位。因此，推测该物质可以由其结构类似物1,4-环己烷二甲醇(1,4-cyclohexanedimethanol, CHDM)在生物催化剂作用下经伯醇氧化反应将处于1-位和4-位的两个羟基氧化为醛基而生成。然而这一反应最大的挑战在于，当CHDM的一个羟基被氧化为醛时，会产生中间产物4-(羟甲基)环己基甲醛(4-(hydroxymethyl)cyclohexanecarboxaldehyde, FHMC)，从而导致物质整体的电子轨道分布发生改变，使另一个羟基由于空电子轨道分布较少而难以被再次氧化生成终产物CHDA(图3-2)。
3.1.2 酶的异源表达及最优菌株的筛选
为了应对这一挑战，本研究基于现有的文献报道，分别筛选出三种不同类型的酶，即醇氧化酶(AOx)、醇脱氢酶(ADH)和漆酶(laccases)，且每种类型的酶分别筛选了三株不同来源的菌株，分别为来源于胆分节杆菌(Arthrobacter cholorphenolicus)、禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)和三口红球菌(Rhodococcus triatomae)的醇氧化酶；来源于硫矿硫化叶菌(Sulfolobus solfataricus)、短杆菌属(Brevibacterium sp.)和马肝(Horse liver)的醇脱氢酶；来源于变色栓菌(Trametes versicolor)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和长绒毛栓菌(Trametes villosa)的漆酶。随后，将所筛的酶基因在表达宿主E. coli BL21(DE3)中进行异源表达，通过对酶活参数的表征及分析筛选出伯醇氧化活性最高的酶为亲本酶进行后续的蛋白质改造。
主要结论
本研究以1,4-环己烷二甲醇(CHDM)为底物，通过醇氧化酶一酶两步法催化1,4-环己烷二甲醇生产1,4-环己烷二甲醛(CHDA)。首先，通过体外转化实验验证了醇氧化酶催化合成CHDA的可行性。其次，对该催化剂进行产酶条件和转化条件优化，进一步提高了CHDA的转化率。随后，对野生型WT与CHDM和FHMC的结构和催化机制分析及半理性设计，通过改变相互作用力调整催化活性构象，显著地缩短了氢化物(H+)转移距离(D(1-C
