本文是一篇医药学论文，本文以CoQ10为原料，以红松籽油为油相，制备基于红松籽油的CoQ10-NE。主要探讨了CoQ10-NE的制备过程及质量评价，并考察了其在大鼠体内的药代动力学以及对结肠癌细胞的抗氧化应激作用。
1 绪论
1.1 CoQ10概述
1.1.1 CoQ10的物理化学性质
辅酶Q10（Coenzyme Q10，CoQ10）是一种脂溶性分子，包含一个中心苯醌部分，其上连接着一个10个单元的聚异戊二烯类脂尾，苯醌环包含氧化还原活性位点，而聚异戊二烯链负责将CoQ10分子定位在各种类型细胞膜脂质双分子层的中间平面内，分子式为C59H90O4，分子量为863.36 Da[1]。不溶于水和甲醇，在水中的溶解度小于1 μg/mL，在光照和碱性条件下不稳定，其结构式见图1-1[2]。由其结构式可以看出，它的侧链具有较长疏水基团，且其分子中没有发现可离子化和成盐的基团，因此，通过改变pH值或成盐的方式去提高其在水中的溶解度均不可行。
CoQ10是线粒体氧化呼吸链中重要的电子载体，参与人体细胞的能量制造，对有氧呼吸至关重要[3]。如图1-2所示，CoQ10主要呈现三种状态：完全还原泛醇形式CoQH2、自由基半醌中间体CoQ10H·、完全氧化的泛醌形式CoQ10。CoQ10虽然在结构上与某些维生素相似，例如维生素K，但它不是维生素，CoQ10在体内合成，而维生素则必须从饮食获得[4]。CoQ10在细胞内可进行氧化与还原两种形式的相互转变，这种转变是泛醌作为电子传递体的基础[5]
1.2 红松籽油的概述
1.2.1 红松籽简介
红松（Pinus koraiensis Sivb.ct Zucc），松科、松属植物，主要分布在中国、俄罗斯、韩国和日本海拔1000米以上的地方。其直径可达1 m，高度可达20~30 m，木质坚硬，在北亚和韩国被广泛用作家具材料[29]。其种子红松籽含有丰富的营养成分，如优质脂肪酸、氨基酸、碳水化合物和维生素等[30]。由红松籽提取得到的红松籽油因其风味独特，常在食品领域应用广泛。同时，由于红松籽油中富含的营养物质使其具有抗氧化、抗肿瘤、抗衰老和抗诱变等活性[31]，同时，还具有减肥降脂的功效[32]。红松籽油因其极高的经济价值和药用价值，世界上已有多个国家对红松籽油进行了研宄与利用，日本已将红松籽油作为功能性食品的原料生产开发了相关保健产品。目前，我国有关红松籽油产品的开发和利用还处于初步阶段，具有优良的前景[33]。
1.2.2 红松籽油的营养功能
红松籽油是由99.4%的非极性脂质和0.60%的极性脂质组成[34]。研究表明，红松籽油通常富含脂肪酸[35]，红松籽油最常见的多不饱和脂肪酸是亚油酸，含量第二丰富的单不饱和脂肪酸是油酸，最主要的饱和脂肪酸是棕榈酸和硬脂酸[36]。以及红松籽油中含有一种独特的Δ5-不饱和聚亚甲基间断脂肪酸—皮诺敛酸，英文名：pinolenic acid，顺-5，9，12-十八碳三烯酸[37]。
红松籽油和皮诺敛酸对人体发挥多种生理功效[38]，具体有如下几个方面的作用：（1）具有抗炎症的功效[39]，通过抑制促炎症因子如NO，PGE2等的生成，从而增强淋巴细胞的免疫功能[40]；（2）具有控制食欲的功效，CCK-8（8-胆囊收缩素）及GLP-1（1-胰高血糖素样肽）可帮助机体消化脂肪，向大脑传递饱腹感信号，降低食欲，减少食物的摄取，从而控制热量的摄取[41]。（3）具有降低血脂的功效[42]，通过调节血液中低密度脂蛋白水平，促进肝循环，从而达到降脂的目的[43]。（4）具有降低血糖的功效，通过强烈地促进FFA1及FFA4（游离脂肪酸受体）分泌[44]，这两种受体可以提高胰岛素的分泌量以及胰岛的敏感度，从而实现降糖作用[45]。（5）具有抗癌的功效，Rose，Connolly等[46]通过人类癌细胞实验，研究发现癌细胞的运动活性和入侵性程度降低，说明皮诺敛酸有抑制癌细胞转移的功效。（6）具有抗氧化的功效，Chen等[47]研究红松籽油可以增加抗氧化酶SOD和GSH-Px在血浆中的含量，同时，降低MDA的含量，从而达到抗氧化目的。
2 红松籽油的提取
2.1 引言
红松（Pinus koraiensis Sivb.ct Zucc），松科、松属植物，广泛分布于我国长白山及周边地区，其种子红松籽富含丰富的营养成分，如优质脂肪酸、氨基酸、碳水化合物和维生素等[87]。红松籽油最常见的多不饱和脂肪酸是亚油酸，含量第二丰富的单不饱和脂肪酸是油酸，最主要的饱和脂肪酸是棕榈酸和硬脂酸。红松籽油具有抗氧化、减肥降脂、免疫抗炎等多种生理功效[88]。
水酶法是指机械粉碎机对植物细胞壁或脂蛋白、脂多糖等复合物粉碎后，采用具有水解作用的酶对含有丰富油脂的植物进行酶解，从而将油脂从油料中释放出来，利用油水密度差异使用离心等方法将油分离出来[89]。同时，超声波会破坏细胞壁结构，导致部分结构塌陷和细胞肿胀。在这种情况下，植物细胞壁和溶液中的酶之间的传质屏障降低，可以加速脂质释放速度，从而有效提高提取率[90]。
本实验采用超声波辅助水酶法高效、绿色地提取红松籽油，通过单因素筛选和响应面法优化其提取工艺，旨在获得一种品质优良、提取率高的红松籽油，从而为下一步CoQ10-NE的制备奠定基础。
2.2 实验仪器与材料
2.2.1 实验仪器
将红松籽剥壳去皮后于70℃鼓风干燥箱中干燥4 h。按一定料液比在10 g破碎过筛后的红松籽中加入蒸馏水，混合均匀后，置于超声波清洗仪中超声处理。在一定条件的超声预处理后，调节混合物的最适pH值和温度，添加一定量的碱性蛋白酶，酶解一段时间后，将恒温水浴锅升温至100℃，灭酶8 min，随后，8000 rpm离心30 min，分离得到上层清油I，将得到的乳状液二次离心，再次分离得到上层清油II，将二次分离上层清油后得到的乳状液于-20℃冷冻24 h，利用冻融和离心相结合的方式破乳，冷冻后的油相晶体刺入水相，可以显著降低乳液的稳定性，达到破乳的目的。将第二次离心后的乳液冻融，再次离心，分离得到顶部残留的游离清油III，将清油I、II、III合并，烘干至质量恒定，按公式2-1计算红松籽油的提取率[91]。
3 红松籽油CoQ10纳米乳的制备和质量评价 ..................................26
3.1 引言 ..............................26
3.2 实验仪器与材料 ..........................27
4 红松籽油CoQ10纳米乳的大鼠体内药代动力学研究 .........................37
4.1 引言 ........................................37
4.2 实验仪器与材料 ...............................37
5 CoQ10-NE对结肠癌细胞的抗氧化应激作用研究 .............................46
5.1 引言 ...................................46
5.2 实验仪器与材料 ...........................46
5 CoQ10-NE对结肠癌细胞的抗氧化应激作用研究
5.1 引言
结肠癌（Cancer colon）被列为全球第三大最常见的恶性肿瘤，约占全球所有癌症的9%。中国属于大肠癌低发地区，但发病率逐年上升。结肠癌的发病原因并不是单一的，其发病往往与环境因素、缺乏运动、吸烟、饮酒、饮食和肥胖等这些因素相关，而这些已知的风险因素之间的交叉影响会导致氧化应激，伴随着ROS的过度产生，从而导致突变并致癌[142]。ROS对细胞造成的氧化损伤也是结肠癌发生的重要机制之一，ROS的累积会导致DNA损伤以及随后染色体的突变，最终导致癌症的发生[143]。因此，从抗氧化应激的角度去研究结肠癌的发生具有一定的科学意义。已有研究表明，抗氧化剂在对抗氧化应激和预防结肠癌的发生中的重要作用。这些抗氧化剂通过降低MDA的含量，提高抗氧化酶系统的活性，最大限度的减少ROS的累积，从而减缓癌症的发生。
本章以H2O2诱导损伤的小鼠结肠癌细胞CT26.WT细胞为模型，从细胞水平上测定CoQ10-NE、CoQ10及空白纳米乳的对H2O2引起氧化应激的保护能力。本章以细胞的存活率，MDA含量、SOD和GSH-Px的含量变化来对比并评价CoQ10-NE的抗氧化能力以及作为结肠癌发展的一种预防剂和保护剂的合理性，为从抗氧化应激角度去治疗和研究结肠癌提供初步的数据支撑和理论指导。
结论
为解决CoQ10在水中溶解度差，提高其累积释放量及生物利用度，本文以CoQ10为原料，以红松籽油为油相，制备基于红松籽油的CoQ10-NE。主要探讨了CoQ10-NE的制备过程及质量评价，并考察了其在大鼠体内的药代动力学以及对结肠癌细胞的抗氧化应激作用。具体结论如下：
1. 红松籽油的提取工艺优化。利用超声辅助水酶法进行红松籽油的提取，通过单因素实验和响应面优化实验，得到红松籽油的最佳提取工艺条件为：在超声强度400 W、超声时间40 min、超声温度50℃的预处理条件下，选用碱性蛋白酶对红松籽进行酶解，响应面优化结果显示，在料液比1∶5 g/mL、加酶量3.23 mg/g、酶解时间2.84 h、酶解温度44℃的条件下，红松籽油的实际提取率可以达到68.15±0.81%。和理论值的相对误差仅为0.29%。且其酸值为0.34±0.10 mg KOH/g，说明酸值较低；皂化值为185.73±0.45 mg KOH/g，说明不饱和程度较高。GC-MS成分分析表明红松籽油富含不饱和脂肪酸
