本文是一篇医药学论文，为了获得能耐受高浓度苯酚且底物广谱性较广的细菌，本研究从南方某工厂长期受污染的活性污泥中筛选与分离得到5株苯酚降解菌，其中菌株A19和JHB5降解苯酚效果最好。
第一章绪论
1.1苯酚的来源及污染的状况
酚类化合物及其芳香族前体作为工业原料和中间体，广泛应用于工业生产活动中[5]。油漆、涂料等各种有机溶剂的使用，酚类化合物已成为室内污染物主要来源[6]。并且环境中的酚类化合物已经影响了人类和生态的安全。
1.1.1苯酚的来源
酚类化合物物的污染主要来自于石油、化工、纺织等工业生产[5]。其中工业和生活废水的排放、化石燃料以及芳香族化合物的不完全燃烧[7]、原油的开采、运输和泄露等都是造成酚类化合物污染的原因[8]。所以酚类化合物的污染主要来源是人类活动。其工业废水中芳香族污染物由于种类复杂，常常需要经过处理才可以排放，并且废水中所残留的芳香族化合物对人类和生态环境危害较大。
1.1.2常见的工业废水的污染物成分
在工业生产中，产生的工业废水常常含有芳香族化合物。芳香族污染物等有机污染物广泛应用于石油、化工、纺织等行业，造成了严重的环境污染，尤其是水污染。很多废水尽管在排放前进行了处理，但是在去除过程中产生的大量剩余污染物质残留，释放到环境中，可能会造成严重的问题。印染类企业、焦化类企业、石化类企业广泛存在大量的芳香族化合物。
1.2处理苯酚废水的方法
苯酚废水含量较大，并且成分复杂，因此处理这类废水较难。现阶段，针对含芳香族化合物废水的方法，按照处理方式可分为化学方法、物理方法和生物方法以及多种方法联合这四种处理方法[20]。1.2.1化学方法化学方法是利用一些化学反应，例如氧化、还原和催化等方式，将废水中的污染物转化成低毒或无毒的物质。常见的化学方法主要包括化学混凝法和化学氧化法以及化学还原法等[21]。
（1）化学混凝法
化学混凝法是加入混凝剂，混凝剂将废水中的废弃物质形成絮凝体，最后采取分离的方法除去。其去除的原理是废水在混凝剂的作用下，电解质冰在水里形成胶水团，并与废水中的胶体发生电中和反应，从而形成绒粒沉降[22]。
（2）化学氧化法
化学氧化法是在高温高压、电、声、辐射、催化等条件下，将难以降解的有机物氧化降解为无毒或低毒的物质，例如直接氧化为水及二氧化碳[23]。其主要原因是生成了羟基自由基，该基团具有强氧化性，能够氧化降解芳香族物质。化学氧化法反应速度极快、降解完全、不产生二次污染、应用范围广。在含酚工业废水处理中，现在研究最多的是高级氧化法[24]，包括Fenton试剂法[25]、类Fenton试剂法[26]、UV/Ti O2法[27]、电化学氧化法[28,29]、以及光催化氧化法[30,31]和超声氧化法[32,33]等。
（3）化学还原法
化学还原法是将废水中难降解有机污染物还原成无毒或低毒的物质。但化学还原法的去除污染物的处理效果不如化学氧化法好，所以化学还原方法没有化学氧化方法受欢迎。
第二章菌株A19对苯酚降解特性的研究
2.1实验材料
2.1.1材料
苯酚污染多来自工业废水，在实际的工业废水中，除苯酚外，还常常含有多种物质，比如盐类和重金属等。并且工业废水的pH值、温度与微生物的最适生长条件相差较大，所以需要更多的环境耐受强的微生物，本研究从长期受污染的活性污泥中筛选出多株苯酚降解菌。并对其进行菌株鉴定、驯化，对影响菌株的降解性能的因素进行了研究，用菌株降解后的苯酚废水进行种子萌发，测试降解废水对植物的毒性。与此同时对菌株对多种芳香族化合物的底物广谱性和产氨、固氮能力分析，探究其菌株的多功能性。
本研究用来分离筛选菌株的样品取自中国南方某工厂活性污泥。本研究所用的菌株A19为从长期受污染的污泥中筛选分离纯化的优势菌株。本研究所用植物种子均为吉林农业大学北门种子超市购买。
2.1.2主要仪器与设备
主要仪器设备见表2-1。
2.2实验方法
2.2.1苯酚降解菌的筛选
（1）菌种的富集将从南方某工厂得到的10g污泥加入到90mL的苯酚浓度为1000mg/L无机盐培养基中，且在37℃，160r/min下充分振荡培养24 h。将污泥里的优势菌株进行富集，为下一步分离纯化做准备[94]。
（2）菌种的筛选分离及纯化用无菌水将富集的菌液梯度稀释，涂布至苯酚浓度为500mg/L无机盐固体培养基上，37℃倒置培养。并将菌落形态不同的菌株进行逐步纯化，得到单一纯菌，保藏至甘油管中备用。
2.2.2菌株鉴定
(1)菌株的形态学鉴定
将菌株接种到有苯酚的无机盐固体培养基上，37℃倒置培养24h，观察其菌落形态。挑取部分菌体进行染色，观察其菌体形状[95]。
(2)菌株的生理生化鉴定
根据《伯杰氏细菌鉴定手册》[96]及《常见细菌系统鉴定手册》[97]对细菌进行生理生化鉴定。
(3)菌株的分子鉴定
将要测定基因序列的菌株接种至LB液体培养基中，37℃，160r/min培养12h，送至测序公司进行16S rD NA基因序列测定。测序结果在BLAST进行基因库比对分析，并在MEGAX软件中以邻位相接法构建系统发育树。最终鉴定得到菌株的分类地位[95]。
第三章生物炭协同芽孢杆菌A19吸附降解苯酚的研究...........................25
3.1实验材料.................................25
3.1.1材料.........................25
3.1.2主要仪器与设备....................25
第四章菌株JHB5对苯酚降解特性的研究.....................................38
4.1实验材料..............................38
4.1.1材料.............................38
4.1.2主要仪器与设备..........................38
结论.............................48
第四章菌株JHB5对苯酚降解特性的研究
4.3结果与分析
4.3.1菌株鉴定结果
(1)菌株的形态学鉴定结果
菌株JHB5对高浓度苯酚具有较好的降解效果且能够良好生长，在500mg/L的苯酚无机盐培养基上观察其菌落形态。如图4-1（a）所示，经观测JHB5的菌落形态为白色，圆形，不透明，表面粗糙。并且如图4-1（b）所示革兰氏染色结果为紫色，是革兰氏阳性菌，其形态（1000×)为杆状。所以JHB5为一株杆状的革兰氏阳性菌。常见的可降解苯酚的菌株为杆状的常有假单胞菌[162]、芽孢杆菌[163]、节杆菌[164,165]、不动杆菌[166,167]、粪产碱杆菌[168,169]等。其中假单胞菌、不动杆菌、粪产碱杆菌为革兰氏阴性菌，并且结合《伯杰氏细菌鉴定手册》[96]及《常见细菌系统鉴定手册》[97]进行分析，菌株JHB5可能是芽孢杆菌、不动杆菌或者其他革兰氏阳性杆菌。其形态学结果还需要结合16Sr DNA结果来进行分析验证。
(2)菌株的分子鉴定结果
为了验证菌株JHB5的形态学鉴定结果，将菌株JHB5送往测序公司进行核酸序列测定。测定得到的16Sr DNA序列，在GenBank数据库中作比对分析，比对结果显示菌株JHB5与芽孢杆菌(Bacillus)相似性为99%。如图4-2所示，根据比对结果构建了菌株JHB5与其他相近菌株之间的系统发育关系。根据同源性分析结果并结合形态学鉴定结果，鉴定该菌株为芽孢杆菌属（Bacillus sp.）。并且已有学者表明芽孢杆菌属的部分细菌可以降解苯酚[170]。
结论
苯酚污染严重威胁着人类的身体健康及生态环境。在众多的处理方法中，微生物降解法由于操作简单，成本较低的优点，越来越多的被人们用于降解苯酚。但是，目前降解苯酚的微生物大多能耐受苯酚的浓度低，并且底物广谱性较差。为了获得能耐受高浓度苯酚且底物广谱性较广的细菌，本研究从南方某工厂长期受污染的活性污泥中筛选与分离得到5株苯酚降解菌，其中菌株A19和JHB5降解苯酚效果最好。
（1）经鉴定，菌株A19属于芽孢杆菌(Bacillus sp.)属。芽孢杆菌A19降解苯酚的效率高。A19可以在22h内将1000mg/L的苯酚完全降解，降解时间约比目前报道的绝大多数菌株（48h）缩短55%。与此同时芽孢杆菌A19的环境耐受性很强，芽孢杆菌A19对温度的耐受范围大，在温度15-37℃的范围内，芽孢杆菌A19降解苯酚降解率能达到100%。并且芽孢杆菌A19相对更喜欢碱性环境。在酸性条件下，芽孢杆菌A19降解效果不佳。在pH7-9的范围内，芽孢杆菌A19降解苯酚降解率能达到100%。但芽孢杆菌A19对盐浓度的耐受性较差，对盐浓度敏感。芽孢杆菌A19对多种高浓度的重金属离子具有良好的耐受性。在100mg/L的Zn2+和Cu2+溶液中，芽孢杆菌A19可以在20h内去除苯酚溶液（1000mg/L）中80%以上的苯酚。且芽孢杆菌A19降解后的含酚废水环境友好。研究表明，用降解后的含酚废水浇灌绿豆、玉米、水稻、甜瓜、羊草和藜麦，其生长状况与用清水浇灌无差异。
（2）芽孢杆菌A19不仅能降解苯类、蒽酮类、酚类、萘类、苯胺类、噁唑类等多种芳香族物质，还可以降解乙草胺和五氯硝基苯这些农药。并且芽孢杆菌A19具有固氮能力，可以促进植物生长，还具有产氨能力，可以为菌株自身生长提供氮源。
（3）为了提高降解苯酚的效率,选用8种生物炭对苯酚进行吸附测试，其中椰壳炭和杏壳炭吸附苯酚效果最好，在10h可以达到吸附平衡。并且杏壳炭与其他生物炭相比，杏壳炭与芽孢杆菌A19耦合去除苯酚效果最好。
参考文献（略）
