本文是一篇医药学论文，本研究成功筛选出了波拉霉素A适配体，并通过RNA structure软件得到稳定的波拉霉素A适配体，以期为后续波拉霉素A的快检技术开发提供前期基础。
第一章 波拉霉素研究进展
1.1波拉霉素简介
1.1.1波拉霉素结构
波拉霉素(Polaramycin)是一种新型农用抗生素，国家发明专利已于1995年2月申报成功。其主要成分为波拉霉素A和波拉霉素B，根据光谱数据可知其分子内具有内酯、半缩酮、丙二酸单酯、胍基等多羟基大环内酯类抗生素共同的结构特征，所以波拉霉素属于多羟基内酯类抗生素。波拉霉素A的分子式为C55H99N3O18，其分子量为1089。波拉霉素 B的分子式为C56H101N3O18，其分子量为1103[1]。波拉霉素化学结构如图1.1所示。
1.1.2波拉霉素理化性质
波拉霉素在常温下处于白色粉末状态，毒性低，它不溶于氯仿、乙酸乙酯和己烷等有机溶剂中，可溶于低级醇和吡啶中。
1.1.3波拉霉素的作用
波拉霉素为多羟基内酯类抗生素，其分子结构中含有抗真菌活性的必要官能团，如半缩酮的六元环和末端胍基。该抗生素对多种产生坏死病斑的真菌都存在着很高的抑制活性，王以光等采用含毒介质法检测了波拉霉素对26种常见农作物病原真菌的抑菌作用，结果表明其对小麦赤霉病菌、苹果轮纹病菌、西瓜枯萎病菌、棉花枯草病菌和黄瓜疽病菌等效果显著，具有广谱抗微生物活性[2]。冯东岳应用平板稻瘟病菌菌丝生长抑制率和凹玻片孢子萌发抑制率为评价农用抗生素抑菌效果的指标，室内实验中，对波拉霉素、生菌素、井冈霉素、农抗120、春雷霉素、宁南霉素进行试验，其中5μg/mL的波拉霉素在20h对稻瘟病菌孢子萌发的抑制率为95.63%，而另外几种效果最好的宁南霉素对孢子萌发抑制率是33.88%。这些试验结果表明：在离体条件下，低浓度的波拉霉素对稻瘟病毒菌具有极好的抑制效果[3]。除此之外，波拉霉素对酵母、丝状真菌及对革兰氏阳性细菌也有一定作用。
1.2波拉霉素高产菌株的构建策略
在链霉菌次级代谢产物的合成过程中，许多基因都对其起到调控作用影响着次级代谢产物的生成，有些基因起到促进抗生素产量的作用，有的则抑制抗生素的生产。因此，许多研究人员通过中断抑制抗生素产生的基因或过表达对抗生素产生有促进作用的基因来达到提高目标物产量的效果。2018年，Huang等人研究了植物油对高产菌株多杀菌素生产的影响[4]，结果表明，添加草莓籽油和芥花油的多杀菌素产量明显高于无油组和大豆油组。此外通过将天蓝色链霉菌[5]中的fadD1基因和fadE基因整合到载体pR M4中，利用质粒pR M4-fadD1-fadE转化出发菌株，获得fadD1和fadE基因过表达菌株ASAGF46。研究结果表明，与出发菌株相比，基因工程菌促进了外源脂肪酸的利用并提高了多杀菌素的生物合成。2007年，Horinouchi等人从A因子蛋白及A因子蛋白受体角度对链霉素的合成进行了研究。研究结果表明，在级联调控作用下，A因子通过A因子结合蛋白将信号传至下游操控链霉素合成和链霉素抗性的两个基因strR和adhD。通过进一步的研究表明，A因子受体与DNA靶点结合阻遏下游基因转录，使其无法合成mR NA，从而抑制了链霉菌的合成。当添加外源A因子，可引起A因子受体从受体-DNA复合物中分离，解除受体蛋白介导的转录阻遏，进而启动链霉素生物合成基因转录。该研究通过解除阻遏的方法促进了转录途径，从而使放线菌对链霉素的生产得到提高[6]。2014年，Wu等人发现了一个新的TetR家族转录调控因子SACE_3986，其作用为负向调节红斑链球菌A226中红霉素的生物合成，对其进行了基因敲除后使得红霉素A的产量增加了54%[7]。2015年Yoo等人对Streptomyces rapamycinicus生物合成基因簇进行序列分析，发现了几个可能的调控基因rapY、rapR和rapS，通过半定量逆转录- PCR在野生型和突变型菌株中的基因表达分析发现，大多数雷帕霉素生物合成基因受到rapS和rapY的负调控，最后通过构建rapS缺失突变体使得雷帕霉素的产量比野生型增加了6.7倍[8]。
2.1材料与仪器
2.1.1培养基
（1）吸水链霉菌固体培养基：
天冬酰胺0.05g，K2HPO4 0.05g，葡萄糖1g，琼脂1.2g，定容到100mL，自然pH。
（2）YPD培养基：
1%酵母，2%蛋白胨，2%葡萄糖，2%琼脂，自然pH。
（3）PDA培养基： 3.7g PDA，2g琼脂，定容至100mL。
（4）吸水链霉菌种子培养基：
黄豆饼粉4g，(NH4)2SO4 0.3g，CaC O3 0.15g，葡萄糖2g，用去离子水定容到100mL，自然pH。
（6）吸水链霉菌初始发酵培养基：
葡萄糖35 g/L、CaC O3 3 g/L、KH2PO4 5 g/L、黄豆饼粉 30 g/L、豆油 5 mL/L、(NH4)2SO4 5 g/L，自然pH。
2.2实验方法
2.2.1菌株的活化与保藏 同1.2.1。
2.2.2 pH测定
使用pH计进行检测。
2.2.3波拉霉素产量的分析
使用高效液相色谱法检测发酵液中波拉霉素的含量。摇瓶发酵结束后，在不同发酵液中取2mL发酵液置于10mL离心管中，加入2倍体积的甲醇，震荡，在4℃下静置过夜，摇匀后取2mL 置于2mL离心管中，12000rpm/min 离心10min，取上清1.5mL置于1.5mL离心管中，最后取1mL置于液相小瓶中，对样品直接进行HPLC检测，对波拉霉素的色谱峰峰面积进行统计，将峰面积值代入到波拉霉素标准曲线方程中计算波拉霉素的产量。
HPLC使用的色谱柱为Cosmosil C18 反相色谱柱（4.6mm x 250nm，5μm ），用45%的乙腈水进行洗脱，均以10μL为样品进样量；以1mL/min作为流动相的流速；紫外波长为220nm；洗脱时间为20min。
2.2.4波拉霉素标准溶液的配制
用45%乙腈水将波拉霉素标品分别配制成浓度为0.5、2.5、5.0、25、50、125、250、500、800mg/L的标准溶液，对波拉霉素标准溶液的分析方法按2.2.2进行HPLC测定，进样量为10μL。记录不同浓度波拉霉素标品溶液的峰面积，并将峰面积（mAU*min）设为纵坐标，波拉霉素产量（μg/mL ）设为横坐标制作波拉霉素标准曲线。
2.2.5发酵培养基单因素优化实验
查阅文献，再考虑到实验室现有的条件，确定了如下原始发酵培养基配方：葡萄糖35g/L、CaC O3 3g/L、KH2PO4 5g/L、黄豆饼粉30g/L、豆油 1.5mL/L、(NH4)2SO4 5g/L。表2.2为发酵培养基单因素试验水平设计表，参照2.2.3对发酵液中的波拉霉素产量进行检测。
第三章 转录组分析氮源添加量对波拉霉素产量影响 ........................ 46
3.1材料与仪器 ......................... 46
3.2实验方法 ............................. 47
3.3结果与分析 ................................. 48
第四章 波拉霉素A适配体的筛选 ..................... 56
4.1材料与仪器 ............................... 56
4.2实验方法 ......................... 57
4.3结果与分析 .............................. 60
第五章结论与展望 ......................... 63
5.1主要研究结果 ............................. 63
5.2论文创新点 ............................ 63
第四章 波拉霉素A适配体的筛选
4.1材料与仪器
4.1.1化学试剂
（1）5 mM Tris-HCl:
0.3g Tris加入490mL H2O，pH至7.5，完全加入至500mL H2O。
（2）Buffer W (10x):
1 M pH为8.0的Tris-HCl，1.5 M NaCl，10mM EDTA。
（3）CS缓冲液1X:
20mM pH为7.4的Tris-HCl，2mM MgCl2， 5mM KCl，1 mMCaCl2，100mM NaC l和0.005% (v/v) Tween-20。
4.1.2主要仪器设备
第五章结论与展望
5.1主要研究结果
本研究成功构建β-氧化路径增强载体、acrR基因敲除载体。通过单因素优化法以及响应面优化法（Box-Behnken）对发酵培养基组分含量进行了优化，从而提高吸水链霉菌对波拉霉素的产量，最终通过Design Expert软件分析出当波拉霉素达到最高产量可时，各发酵培养基组分含量分别为(NH4)2SO4 2 g/L，KH2PO4 3.62g/L，葡萄糖 35g/L，豆油4mL/L，CaC O3 6g/L，黄豆饼粉25g/L，对优化后的发酵培养基产量进行了验证，结果表明，波拉霉素产量达到了771.56μg/mL ，比原始培养基增产量加了近5倍。
本研究通过RNA-seq对高氮源添加量和低氮源添加量培养基中吸水链霉菌（S. hygroscopicus）进行转录组测序分析出受影响差异较大的几个途径，分别为糖酵解途径、TCA途径、精氨酸合成途径以及缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的生物合成途径。这些路径的改变与波拉霉素的关系需通过进一步实验证实。
此外，本研究成功筛选出了波拉霉素A适配
