胸腔积液诊断间变性大细胞淋巴瘤细胞病理学分析
摘要：目的报道1例胸腔积液诊断间变性大细胞淋巴瘤并进行文献复习，以加强对淋巴瘤细胞学诊断的认识。方法胸腔积液常规细胞学涂片、沉渣包埋，结合免疫组化染色及T细胞受体基因重排，从细胞学角度明确诊断间变性大细胞淋巴瘤。结果胸腔积液涂片中细帮写博士论文胞丰富，可见大量散在分布的肿瘤细胞有3种:单核、双核和多核细胞;单核淋巴细胞核浆比高，核呈肾形，核仁明显;多核细胞核排列成花环状或马蹄形，可见多个核仁;双核细胞类似霍奇金淋巴瘤中的R-S细胞。肿瘤细胞胞质丰富，嗜酸性，胞质内可见空泡。背景可见小的成熟淋巴细胞及间皮细胞。沉渣包埋免疫组化示CD30、ALK、CD68、granzymeB和CD4(+)，CD15和MUM1(－);散在瘤细胞CD5(+)，CD3、CD8和CD20、CK5/6、calretinin和pan-CK(－)。颈部淋巴结活检证实为间变性大细胞淋巴瘤。T细胞受体基因重排为(－)。结论胸腔积液诊断间变性大细胞淋巴瘤少见，难度高。诊断对免疫组化的依赖程度较高。
关键词：淋巴瘤;间变性大细胞淋巴瘤;原发性渗出性淋巴瘤;胸腔积液
间变性大细胞淋巴瘤(anaplasticlargecelllymphoma，ALCL)是一种少见的非霍奇金恶性淋巴瘤(NHL)，WHO(2010)造血和淋巴组织肿瘤分类将其归入T细胞淋巴瘤，占NHL的3%［1］。ALK阳性者多见于年轻男性，阴性者多见于老年人，肿瘤进展较快，恶性程度高，但对化疗敏感。ALCL的诊断主要依靠浅表淋巴结的活检及一些辅助性的诊断方法(免疫组化、基因重排等)，通过胸腔积液诊断ALCL比较少见，国外仅见个案报道，国内尚未见报道。本文报道1例伴有一侧胸腔积液的ALCL，并复习相关文献，探讨体液内ALCL细胞的细胞学及免疫组化特点，以期提高渗出液诊断淋巴瘤的经验。
1材料与方法
1.1临床资料患者男性，25岁。因发热、左颈部淋巴结肿大1个月就诊。1个月来午后低热，最高T37.7℃，伴左颈部疼痛。查体:左颈可触及肿大结节2个，分别为2.5cm×2cm和1cm×0.8cm大小。血常规检查未见异常，血沉、CRP高于正常，肝功各项指标均异常。EB病毒、CMV病毒血清抗体滴度均在正常范围内。患者既往身体健康，无艾滋病史，无免疫抑制剂服用史，起病以来发生2次口腔溃疡。入院后做骨髓穿刺，骨髓涂片未见异常;骨髓活检显示骨髓造血组织比例大致正常，未见异常细胞。腹部CT示脾大，有副脾，腹膜后及肝门区多发小淋巴结。胸部CT示双肺内多发结节影，右肺胸膜下线影，左侧胸腔积液。PET-CT发现全身多处代谢增高的淋巴结;骨多处代谢增高灶;多处肌肉代谢增高灶，左后下胸膜代谢增高灶，左侧大量胸腔积液，结合临床高度怀疑淋巴瘤。入院2周后再次查体，于双侧颈部、锁骨下、双侧耳前、双侧腋窝、双腹股沟均可触及肿大淋巴结，最大者2cm×1.5cm大小，质韧、轻压痛。取锁骨下淋巴结活检，并抽取胸腔积液送检。
1.2方法
1.2.1涂片及沉渣包埋送检胸腔积液250ml。取5ml于试管2500r/min离心5min，弃上清，取沉淀红细胞上的白膜涂片2张，HE染色。取胸腔积液5ml按上述方法离心，取沉渣石蜡包埋、切片，HE染色。颈部活检的淋巴结4%甲醛固定，石蜡包埋，薄切后HE染色。
1.2.2免疫组化沉渣包埋蜡块和活检淋巴结切片均做免疫组化。免疫组化采用EnVision染色法。抗体包括CD3、CD4、CD5、CD8、CD20、CD15、CD30、CD68、ALK、CK5/6、calretinin、pan-CK、EMA、MUM-1、granzymeB等，均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。结果评分:所有肿瘤细胞均不着色为(－)，个别细胞着色为(±);着色细胞5%～25%为(+)，26%～50%为()，＞50%为()。
1.2.3TCR重排取胸水50ml离心，沉渣用QIAampDNAMinikit(QIAGEN公司，德国)试剂盒按照说明书提取基因组DNA作为样本。样本均先进行DNA质量检测，可检测出300bp及以上条带的样本进行下一步的TCR重排检测，3盒共6管多重TCR反应体系均设相应的阳性、阴性及空白对照。PCR扩增产物进行异源双链分析后，与含有核酸染料的上样缓冲液混合，进行8%的聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)垂直电泳，凝胶成像系统扫描并观察结果。结果判读依试剂盒说明书，对不明确结果样本进行重复检测。
2结果
2.1细胞学检查常规涂片镜下见细胞丰富，单个散在，很少聚集;未见乳头状结构及成团排列的细胞。共见3种细胞:①较多高核浆比的单核淋巴细胞:细胞核形状不规则，呈圆形、椭圆形及马蹄形(肾形)，核仁清楚(图1A);②散在的多核细胞:细胞核排列成花环状或马蹄形，可见多个核仁(图1B);③双核细胞:核染色质空泡状，核仁明显，似霍奇金淋巴瘤中的R-S细胞(图1C);3种肿瘤细胞的胞质嗜酸性，可见空泡。除以上类型的肿瘤细胞外，背景中还可见到小的成熟的淋巴细胞及间皮细胞。沉渣包埋后HE切片，细胞形态与涂片基本相同，3种肿瘤细胞均可见到(图2)，粉染的背景下细胞仍散在分布，无成团结构。
2.2免疫组化异型性大的单核细胞、多核细胞及双核细胞CD30均强(+)，棕黄色颗粒沉积在细胞膜和细胞质内高尔基体密集区(图3);肿瘤细胞EMA和ALK(图4)强(+)，CD68和granzymeB弥漫强(+)，CD15和MUM-1均(－)。背景中小的成熟的淋巴细胞CD3和CD20(+)，肿瘤细胞均(－)，其他广谱B细胞标记物也为(－);CD4弥漫强(+)。散在的单核大细胞及背景中部分小淋巴细胞CD5(+)，其他的T细胞标记物CD3、CD8肿瘤细胞均为(－)。间皮细胞CK5/6、calretinin和pan-CK(+)，肿瘤细胞(－)。
2.3TCR基因重排胸腔积液细胞中提取的基因组DNA质量高，质控PCR扩增后得到的产物长度＞300bp。TCR基因重排结果显示，TCRG、TCRB、TCRD基因均无克隆性重排(图5)。
2.4组织学检查同期活检颈部淋巴结1枚，大小2cm×1cm×0.5cm，表面有包膜，尚光滑，切面灰粉色，实性、质中。镜下淋巴结结构消失，部分区域呈结节状;高倍镜下，可见成片大的上皮样细胞，较多核分裂。细胞核肾形，染色质空泡状，核仁清楚，偶见多核细胞;细胞质丰富、嗜酸性。形态显示为典型的间变性大细胞淋巴瘤(图6)。免疫组化结果同细胞学涂片。
病理诊断:(颈部淋巴结)间变性大细胞淋巴瘤(ALK+)。
细胞学诊断:(胸腔积液)找到瘤细胞，病变符合间变性大细胞淋巴瘤(ALK+)。
患者DEX化疗1个疗程后出院，随诊病情明显缓解，体温正常，淋巴结触诊不明显，左侧有少量胸腔积液，目前患者仍在当地对症治疗。
3讨论
间变性大细胞淋巴瘤(ALCL)是高级别恶性非霍奇金淋巴瘤，可发生在所有年龄组，＜20岁者约占20%［1，2］。多数病例是原发性的，少数可继发于HIV感染、霍奇金淋巴瘤等。临床上有两种表现形式:系统性和原发皮肤性。系统性ALCL累及淋巴结、骨髓、骨、呼吸道和胃肠道等部位，侵袭性很强;皮肤性ALCL主要发生于成人，为惰性病程，个别病例甚至可自发消退。系统性ALCL的诊断主要依靠浅表淋巴结的活检，镜下淋巴结结构消失，肿瘤细胞成片弥漫生长，类似淋巴结转移癌或恶性黑色素瘤等;肿瘤细胞核浆比高，细胞异型性明显，细胞核常呈马蹄形，核仁清楚，胞质丰富略嗜酸，常见多核和双核瘤细胞，后者类似霍奇金淋巴瘤中的R-S细胞。免疫组毕业论文帮写http://www.51lunwen.org/ba_degree.html化示CD30阳性，偶尔CK阳性，近半数病例可有T细胞标记阳性，没有B细胞标记。ALK阳性不是诊断ALCL的必要条件［3］。一部分ALCL出现染色体异位，t(2;5)最为常见，导致ALK基因和NPM基因异位，合成新的ALK蛋白，多发生在年轻患者。免疫组化ALK阳性提示该ALCL存在此种染色体异位，预后相对较好。T细胞受体基因重排(TCR)阳性率50%～90%不等［1，2］。本例CD30染色弥漫强阳性，T细胞标记物CD4阳性，余为阴性，ALK染色强阳性，TCR重排阴性。单纯依靠胸腔积液诊断ALCL困难很大，需要有丰富的经验。国外文献中细胞学诊断淋巴瘤的报道常能看到［4－9］，大部分脱落细胞学诊断ALCL时都已知患者有实体肿瘤，仅有几例报道脱落细胞学诊断为首诊［4－6］。涂片上的肿瘤细胞与组织切片上的形态极为相似，肿瘤细胞黏附性差，多单个散在分布，单核细胞、双核细胞及多核细胞均可见到，细胞核大小不等，形状不规则，核仁清楚，染色质空泡状，细胞质嗜酸性。本例胸腔积液诊断时全身多处浅表淋巴结肿大，颈部淋巴结同期取活检，进一步验证了我们的诊断。
本例患者第一次抽取胸腔积液时，由于胸腔积液中肿瘤细胞比例相对较少，我们诊断为增生的间皮细胞;再次送检胸腔积液，那些核浆比高的单核淋巴细胞增多，引起我们的注意。沉渣包埋免疫组化后支持ALCL的诊断，重新调阅第一次胸腔积液涂片，发现涂片中还是可见少量高核浆比的单核淋巴细胞散在分布，多核及双核肿瘤细胞核形不整、扭曲，与间皮细胞不同，核有一定的异型性。诊断的关键是要认识ALCL在涂片中细胞的种类和特点。ALCL在胸腔积液中可见到3种肿瘤细胞，每种细胞都有比较显著的特点，掌握这些特点识别它，结合免疫组化不难诊断。
鉴别诊断主要包括:①首先要判断是淋巴瘤还是低分化癌、间皮瘤、恶性黑色素瘤等，免疫组化很容易鉴
