本文是一篇医药学论文，本研究共探究了泰拉霉素6个给药剂量（2.5、5、7.5、10、15、20 mg/kg）对于治疗猪胸膜肺炎放线杆菌的效果，整合药动学与药效学数据，使用WinNonlin软件对PK/PD三个参数与细菌变化量的关系进行相关性拟合。
1 前言
1.1 立题依据
猪传染性胸膜肺炎在世界范围内均有分布并对养猪业造成严重损失，因此在国际上被列入制约生猪养殖业发展的五大疾病名单之中（Hoflack et al., 2001），该病由胸膜肺炎放线杆菌（Actinobacillus Pleuropneumoniae，APP）引起，是一种具有高度传染性的猪呼吸道疾病，剖检通常可见胸膜炎和出血性坏死性肺炎的病理症状。且往往可以发现该病出现在各种年龄段的猪，并常与巴斯德氏菌发生混合感染（杨凡凡，2017），具有高发病率与死亡率。猪胸膜肺炎放线杆菌可通过水平传播，如患病猪的痰液、鼻液及飞沫都能成为该病发生的传染源（杨凡凡，2017），其还可经垂直传播，如在引种、配种过程中也能导致该细菌的传播。而猪一旦感染该病，其生长发育与其他生产性能将会受到严重影响，给我国甚至世界生猪养殖业造成不可估量的经济财产损失。因此，预防和控制这种疾病已成为当今生猪养殖业亟待解决的问题。目前，主要通过接种疫苗的方式预防猪传染性胸膜肺炎，而在兽医临床上，治疗该病则常使用泰乐菌素与替米考星等其他抗生素。由于泰乐菌素和替米考星在兽医临床上使用较为广泛与频繁，以及大量滥用这些抗生素的不良习惯，致使细菌对这些抗生素的耐药性逐渐增强，进而导致其临床药效显著下降。为了改善细菌耐药性逐年增加的状况，科学工作者们最近十多年也研究发现了一些半合成的大环内酯类抗生素，如泰拉霉素与泰地罗新等。这些近期研究发现的抗生素与传统的大环内酯类抗生素相比较，具有更显著的药理效应，如泰拉霉素具有较强的抗菌活性、抗菌谱广，在动物体内吸收迅速、生物利用度高、药效持久、单次给药即可完成整个治疗过程等优点（周磊，2008）。因此，目前泰拉霉素已被成功用于治疗造成严重经济损失的牛、猪呼吸道疾病（张刚等，2017）。
1.2 猪胸膜肺炎放线杆菌的研究概况
胸膜肺炎放线杆菌是一种微量需氧，有荚膜包裹的革兰阴性细菌。该菌是引起猪传染性胸膜肺炎和纤维蛋白胸膜肺炎的最重要的病因（Haesebrouck et al., 1997）。在1983年，它被归类为巴斯德氏菌家族的放线杆菌属。此外，根据它们的外膜结构成分、环境要求、代谢及致病性的不同，APP血清型可分为15种（张飞等，2016；厚华艳等，2015）。而根据APP生长是否依赖烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide，NAD），可对其生物类型进行分类。其中，依赖NAD的为生物Ⅰ型，不需要NAD的为生物Ⅱ型（郭坤等，2017）。
猪传染性胸膜肺炎（porcine contagious pleuropneumonia，PCP）可感染任何年龄段的猪（任洪丽，2018），其中以3月龄、体重为30～60 kg的猪易发。尤其在寒冷的冬天、每年的2月份和10月份等气候条件不好的时期，常常可以看到猪群发病（李红艳，2017）。PCP的传染源为患病猪、带毒猪、没有临床症状但出现病理变化的猪、既没有临床症状也没有病理变化的隐性带菌猪。在大多数情况下，PCP通过呼吸道传播，也有少部分通过其他途径感染，如接触传播。且该病的血清型较多，流行性广。
本病潜伏期往往为1～2 d，人工实验感染为1～7 d。该病出现有3种类型，分别是最急性型、急性型、亚急性或慢性型。其中，最急性型病例，通常无预警，病程急促，未发现明显临床症状忽然死亡。病死猪末梢皮肤呈发绀状，从口、鼻流出带有泡沫的血色液体（刘速宽，2014）。而在急性型病例中，病程往往长短不一，且猪群一般整体发病，体温较正常猪升高1～2℃，食欲下降，腹泻，呼吸吃力，心跳频率升高。病猪通常会发生心力衰竭而于48 h后死亡（任洪丽，2018）。耐过猪可能恢复健康或转变为慢性感染。慢性型或亚急性型症状相对较轻，出现间断性咳嗽，若受外界环境影响则会出现腹式呼吸，生长发育速度减慢、瘦削。有的病猪眼观无可见相应症状而呈隐性感染藏于猪群中。
2 实验材料与方法
2.1 实验材料
2.1.1 药品与试剂
泰拉霉素注射液（Draxxin，即瑞可新）：规格：20 mL：2 g，批号：B098112，法瑞瓦公司法国生产厂；
泰拉霉素对照品：含量98.8％，批号：BN1703001，山东鲁抗舍里乐药业有限公司；
戊巴比妥钠：翔博生物科技有限公司；
盐酸普鲁卡因注射液：批准文号：国药准字H50021215，太极西南药业股份有限公司；
四环素软膏：批准文号：H44023931，广东恒健制药有限公司；
注射用青霉素钠：400万单位/支，批号：20160301，四川佳泰动物药业有限公司；
氯化钠注射液：批准文号：国药准字H20061063，青岛金峰制药有限公司；
碘酊：批准文号：卫消字（2006）第0052号，江西汇康实业有限公司；
苯扎溴铵消毒液：批号：160319，南昌华鑫医药化工有限公司；
乙腈（HPLC级）：含量≥99.9％，美国Fisher公司；
甲酸（HPLC级）：含量≥99.9％，美国Fisher公司；
胰蛋白胨大豆肉汤培养基：Tryptic Soy Broth（TSB），广东环凯生物科技有限公司；
胰蛋白胨大豆琼脂培养基：Tryptic Soy Aga（rTSA），广东环凯生物科技有限公司；
新生牛血清：广州蕊特生物科技有限公司；
氧化性辅酶I（NAD）：批号：20160810，MYM BIOLOGICAL TECHNOLOGY
2.2 药物检测方法
2.2.1 组织液样品前处理方法
组织液样品自然解冻后，准确吸取0.2 mL样品于1.5 mL离心管中，加入等体积的乙腈涡旋混匀1 min。然后离心10 min（4℃，13000 r/min）。吸取0.2 mL上层清液于另一个1.5 mL的塑料离心管中，加入0.8 mL流动相初始比例的溶液（0.1％甲酸水：乙腈=9：1），涡旋1～2 min，使溶液充分混匀后，通过0.22 μm过滤器过滤后，在HPLC-MS/MS上进行检测。
2.2.2 HPLC-MS/MS条件
液相色谱条件： 色谱柱：Luna C18（150 mm×2 mm，5 μm） 流动相：0.1％甲酸水（A）和乙腈（B） 流速：200 μL/min 柱温：40℃ 进样量：5 μL 梯度洗脱程序见下表：
3 结果与分析 ························ 19
3.1 检测方法的验证 ······················· 19
3.1.1 方法的特异性 ···························· 19
3.1.2 标准曲线与线性范围 ····························· 20
4 讨论 ·················· 28
4.1 分析化合物的选择 ······················· 28
4.2 组织笼模型 ·························· 29
4.3 泰拉霉素对猪胸膜肺炎放线杆菌的体外药效学 ······················ 30
5 全文总结 ······················· 35
4 讨论
4.1 分析化合物的选择
在溶液、生物液体及组织中，泰拉霉素的两种同分异构体以9：1的比例稳定存在，其中泰拉霉素A（15元氮杂内酯环）为主要同分异构体，因此，所有的临床关注度都集中在这个主要同分异构体上（Evans, 2005）。查阅文献，可以看到，很多国内外的文章都以泰拉霉素A作为泰拉霉素浓度的分析化合物。如Scheuch等（2007）使用液相色谱-串联质谱方法定量测定驹的血浆以及支气管肺泡细胞中泰拉霉素药物浓度时，监测的也是泰拉霉素A。此外，Gajda等（2016）在研究感染猪胸膜肺炎放线杆菌的猪体内泰拉霉素的药动学及肺组织泰拉霉素药物浓度分布时，亦用泰拉霉素A作为定量标准。因此，本文研究通过分析泰拉霉素A的药物浓度来代替泰拉霉素药物浓度。
5 全文总结
（1）本文通过在仔猪体内建立组织笼感染模型，开展了泰拉霉素对猪胸膜肺炎放线杆菌（CVCC259）的PK/PD模型研究。该模型通过在仔猪的颈部皮下组织植入组织笼，待外科手术恢复后，经穿刺接种108 CFU/mL（约0.5 mL ）的菌悬液到组织笼内，3 h后细菌数量达到稳定，从而建立起可靠的组织笼感染模型。
（2）本研究测得泰拉霉素在猪血清和组织液中对猪胸膜肺炎放线杆菌的MIC均为0.25 μg/mL。
（3）颈部肌内注射泰拉霉素（2.5 mg/kg b. w.，单剂量给药），在猪组织液中迅速达峰，达峰浓度高，消除半衰期较长。说明泰拉霉素具有吸收迅速，生物利用度高，组织分布广泛和药效持久的优良药动学特性。
（4）从泰拉霉素对猪胸膜肺炎放线杆菌的体外和体内杀菌曲线图，可以看到，泰拉霉素对猪胸膜肺炎放线杆菌具有强而高效的杀菌作用，6 h内基本能够杀灭细菌，具有极佳的临床适用性。
（5）本研究共探究了泰拉霉素6个给药剂量（2.5、5、7.5、10、15、20 mg/kg）对于治疗猪胸膜肺炎放线杆菌的效果，整合药动学与药效学数据，使用WinNonlin软件对PK/PD三个参数与细菌变化量的关系进行相关性拟合。拟合结果显示，在猪体内组织笼感染模型中，AUC0～24h/MIC是描述泰拉霉素抗菌效应的最佳PK/PD参数（R2=0.9408）。该结果可为后续分析泰拉霉素在猪体内的抗菌效应提供思考方向。
（6）应用WinNonlin软件的Sigmoi
