本文是一篇医药学论文，本研究中的多个质粒均为典型的IncF33质粒，如pHNBC6-3，而pHNBS21e、pH NTS62和pHNBS17e为IncF33杂合质粒。IncFIIs质粒型pHNTS45仅与NCBI里个别质粒相似，从可变区开始到分配系统缺失大片段序列，可能是因为其有较多移动元件如IS110、Tn3等夹带着质粒片段形成环状中间体脱落出原生质粒，再自行组装而成。
1 前言
1.1 磷霉素概述
磷霉素是由美国MERCK公司和西班牙CEP公司1969年从土壤培养的链霉菌中获得的一种广谱天然抗生素（Hendlin et al., 1969）。磷霉素是一种磷酸衍生物，其化学名为顺式-1R，2S-1，2环氧丙基磷酸，化学结构中主要包含1个环氧环及1个天然产物中不常见的C-P键（Higgins et al., 2005）。磷霉素由于其化学结构简单独特，分子量低（138.06 g/mol）药物半衰期（5.7±2.8 h）较长，很容易穿透各种组织并达到最低抑菌浓度以抑制细菌生长（Michalopoulos et al., 2011）。磷霉素广泛分布于组织和体液中，组织浓度在肾脏中最高，其次为心、肺、肝脏等器官。磷霉素是一种相对较小的强极性亲水性试剂，在体内不进行代谢，主要通过肾小球滤过在尿液中无变化地排出，故在尿道系统可维持较长时间高浓度。注射后24 h内有90%左右的给药量从尿中排出，故临床上主要用于治疗尿路感染（Falagas et al., 2008）。
1.2 国内外使用磷霉素情况及耐药状况
1975年磷霉素进入临床使用，至今主要有三个品种：磷霉素钙、磷霉素钠、磷霉素氨丁三醇。在中国，磷霉素一般用于成人与儿童消化和呼吸道感染，尿路感染，通常与其他抗生素联合使用治疗重症感染。在美国，磷霉素的唯一适应症是治疗由大肠埃希菌或粪肠球菌引起的下尿路感染。然而，磷霉素在日本、欧洲、巴西等地的使用范围明显扩大，静脉注射磷霉素钠用于治疗脓毒症、软组织感染及深部感染已经在欧洲等地成功使用三十多年（尹雄章等，2011）。
尽管磷霉素已在临床上使用了近五十年，但它仍具有良好的抗菌活性。国外学者Falagas等（2010）对磷霉素抗菌活性所作综述中发现，17篇文献（共5057株临床分离肠杆菌）中有11篇对磷霉素的敏感率达到90%以上。十年前，磷霉素仍被认为是治疗临床多重耐药大肠杆菌感染的一种选择（陆桃红等，2009）。日本、欧洲等人医临床上使用磷霉素多年的国家大肠杆菌对磷霉素的耐药率都很低。2010年Wachino等报道日本人医临床产blaCTX-M基因大肠杆菌对磷霉素的耐药率为仅3.6% （Wachino et al., 2010），在韩国为4.8%（Lee et al., 2012）。我国学者2010年至2013年从医院病人身上分离产ESBLs肺炎克雷伯氏菌对磷霉素耐药率为12.5%（Jiang et al., 2015），台湾地区2013年分离医院人源产ESBLs大肠杆菌对磷霉素耐药率6.5%（Tseng et al.,2015），Cao等（2017）发现分离自2010年至2014年医院人源产ESBLs大肠杆菌对磷霉素耐药率达到12.3%，高于台湾耐药水平。最近英国学者对医院革兰氏阴性菌感染的儿童患者进行多种抗生素抗菌活性的研究时发现，90%的肠杆菌及96%的假单胞菌对磷霉素处于敏感状态，社区获得与医院获得的致病菌均表现对磷霉素高度敏感（Williams et al., 2019）。
2 材料与方法
2.1 材料
2.1.1 样品来源
本试验室保存的2015～2016年分离自广州市天河区、白云区、越秀区、海珠区、荔湾区等地区肉菜市场及超市的233株产ESBLs蔬菜源肠杆菌，包括克雷伯氏菌（肺炎克雷伯氏菌及其它亚型）164株，大肠杆菌28株，阴沟肠杆菌15株，柠檬酸杆菌12株，解鸟氨酸拉乌尔菌3株，克雷吕沃氏菌2株，其它革兰氏阴性菌3株。
2.1.2 标准菌株及载体
标准菌：大肠杆菌ATCC®25922为本试验室保存。
工程菌：大肠杆菌C600为本试验室保存。化转感受态细胞大肠埃希菌DH5α购买自宝生物工程（大连）有限公司。
2.1.3 抗菌药物
2.2 方法
2.2.1 磷霉素耐药基因的检测
（1）基因组DNA的提取
采用煮沸法提取基因组DNA。用接种环挑取在麦康凯平板上生长的单菌落接种于含256 μg/mL磷霉素的LB平板上，37℃培养12～16 h后，刮取适量的菌苔至含0.4 mL 1×TE的灭菌1.5 mL离心管中，振荡混匀于100℃金属浴10 min，迅速放置冰上冰浴10 min，13200 rpm离心5 min，将上清液置于新的无菌1.5 mL离心管中。
（2）引物设计与合成
引物参考Bernat（1997）、Nakamura（2014）、Ma（2015）、Wachino（2010）等报道设计，并由苏州金唯智生物科技有限公司合成相关引物，引物序列见表3：
3 结果与分析 ···························· 32
3.1 磷霉素耐药基因检测结果 ················· 32
3.2 fosA3阳性菌中其他耐药基因的检测结果··················· 32
4 全文讨论 ·························· 52
4.1 磷霉素耐药状况及fosA3基因在肠杆菌中的流行情况 ·············· 52
4.2 fosA3阳性肠杆菌的耐药特征分析 ····················· 53
5 全文总结 ······························ 55
4 全文讨论
4.1 磷霉素耐药状况及fosA3基因在肠杆菌中的流行情况
自1969年发现以来，磷霉素已在临床上使用了近50年，但仍具有良好的抗菌活性。近年来随着磷霉素的广泛使用，关于磷霉素耐药性的报道也随之增多。截止2010年，大部分文章报道的肠杆菌科细菌对磷霉素的敏感率达到90%以上（Falagas et al., 2010）。fosA3基因通常位于质粒中，主要存在于人、动物、食品和环境中的大肠杆菌、肺炎克雷伯菌和沙门氏菌中。在人医临床上，日本、欧洲等使用磷霉素多年的国家大肠杆菌对磷霉素的耐药率都很低。
Wachino等（2010）报道日本人医临床产CTX-M大肠杆菌对磷霉素的耐药率仅为3.6%。Lee等（2012）报道韩国产CTX-M大肠杆菌对磷霉素的耐药率为4.8%。中国人医临床上分离自2009年至2010年的大肠杆菌对磷霉素耐药率为7.8% （Li et al., 2015））。2013年台湾地区部分医院分离得到产ESBLs大肠杆菌对磷霉素显示为6.5%的耐药率（Tseng et al., 2015），而产KPC的肺炎克雷伯氏菌耐药率远远高于产ESBLs大肠杆菌与普通大肠杆菌，耐药率为58.8%（Xiang et al., 2015）。2010至2014年在台湾医院病人尿样中分离得到的ESBLs大肠杆菌对磷霉素耐药率上升到12.3%（Cao et al., 2017）。同一时期报道的法国人源大肠杆菌对磷霉素仍处于敏感状态，耐药率仅为1%（Benzerara et al., 2017）。中国人源的碳青霉烯耐药肺炎克雷伯氏菌对磷霉素耐药率较高，为28.7%（Jiang et al., 2015）。最近瑞士有学者报道对2012年至2013年社区病人身上分离得到的1225株产ESBLs大肠杆菌中进行磷霉素耐药性分析，检出17株磷霉素耐药菌株，耐药率为1.4%（Mueller et al., 2019）。目前，fosA3在大部分国家人源肠杆菌中的携带率仍较低（<10%），仅在中国及一些亚洲地区人源产碳青霉烯酶肺炎克雷伯氏菌较高，携带率处于6.8%～45.3%之间，个别报道高达82.3%（Wang et al., 2018）。
5 全文总结
（1）我国广州地区蔬菜源产ESBL肠杆菌中质粒介导的磷霉素耐药基因主要为fosA3 基因，检出率为7.3%。
（2）fosA3基因由多种质粒携带，除了大肠杆菌中常见的IncFII型质粒与IncHI2型质粒，另外还在肺炎克雷伯菌中发现未报道过的新型质粒也介导fosA3的传播。
（3）fosA3通过插入序列IS26在不同质粒间进行转移，常与blaCTX-M基因共转移。
参考文献（略）
