本文是一篇医药学论文，笔者经过分析，得出结论：IncHI2质粒可以携带多种耐药基因，而IncI2和IncX4质粒虽然也存在同时携带两种耐药基因的现象，但在该养殖场流行较少。在2017年停止使用硫酸黏菌素作为动物促生长剂后，黏菌素选择性压力消失，但mcr-1基因仍然存在，多种药物共选择可能是其存在的原因之一。
2材料与方法
2.1实验材料
2.1.1样品来源
本实验室保存的2013年～2018年间从安徽地区某肉鸡场采集的健康肉鸡肛门拭子，共分离、鉴定出大肠杆菌552株，具体菌株信息见表1。
2.2实验方法
2.2.1细菌的复苏
本实验室临床分离菌的保存是将细菌置于30％甘油肉汤中，制成甘油菌，保存于-80℃冰箱。将保存菌取出，将菌液充分混匀后，吸取100μL接种于2 mL LB肉汤中，37℃、180 r/min振荡培养16～18 h。用接种环沾取适量菌液，划线接种于麦康凯固体培养基上，37℃静置培养16～18 h，以备提取DNA模板、重新保菌及后续进行接合和转化等实验。
2.2.2多种重要耐药基因及质粒的检测
（1）基因组DNA模板的制备
用接种环挑选麦康凯培养基上的大肠杆菌单菌落，均匀涂布于LB固体培养基上，37℃静置培养16～18 h。取1.5 mL离心管加入500μL 1×TE，刮取适量菌苔置于离心管内，充分振荡混匀，103℃金属浴15 min，冰浴10 min，12000 r/min离心5 min，吸取上清液至新的灭菌1.5 mL离心管中，放置于4℃保存备用。
（2）重要耐药基因及质粒引物合成
根据参考文献报道的引物序列，由华大基因科技有限公司合成，引物序列表见2。
3结果与分析
3.2重要质粒型检测结果
对安徽某肉鸡场2013年～2018年分离的552株大肠杆菌中IncHI2、IncFⅡ、IncI2、IncI1和IncX4质粒流行情况进行调查。结果显示，在该肉鸡场大肠杆菌中IncHI2、IncFⅡ和IncI2质粒较为流行，检出率分别为32.61％、26.63％和26.45％，IncI1和IncX4检出率较低，分别为6.52％和2.54％（表13）。
3.3重要耐药基因PCR检测结果
运用PCR技术，对安徽某肉鸡场连续6年分离到的552株大肠杆菌进行blaC TX-M、fosA3、rmtB和mcr-1四种临床重要耐药基因进行检测，具体检测结果见表14。
3.3.1 blaC TX-M基因检测结果
从表14可以看出，blaC TX-M检出率最高，共有435株（78.80％）鸡源大肠杆菌携带blaC TX-M基因。其中blaC TX-M-1G检出率为44.75％（248/552），6年的检出率从35.16％到55.42％不等；blaC TX-M-9G检出率略高于blaC TX-M-1G，为49.82％（272/552），6年间的检出率从36.92％到79.69％不等（图6）。blaC TX-M-1G包括blaC TX-M-55（n=194）、blaC TX-M-64（n=21）、blaC TX-M-123（n=14）、bla CTX-M-15（n=11）、blaC TX-M-132（n=4）、blaC TX-M-82（n=3）和blaC TX-M-3（n=1），其中最流行的基因型为bla CTX-M-55，占78.23％（194/248）。bla CTX-M-9G包括blaC TX-M-14（n=130）、bla CTX-M-65（n=100）、bla CTX-M-27（n=22）、blaC TX-M-24（n=16）、blaC TX-M-17（n=2）、bla CTX-M-121（n=1）和bla CTX-M-98（n=1），其中广泛流行的基因型为blaC TX-M-14和blaC TX-M-65，分别占47.79％（130/272）和36.76％（100/272）。
3结果与分析···································21
3.1细菌的复苏结果································21
3.2重要质粒型检测结果·····························21
4讨论与结论····································40
4.1肠杆菌中流行质粒的分析·······························40
4.2耐药基因流行性分析·····························41
5全文总结··························44
4讨论与结论
4.1肠杆菌中流行质粒的分析
肠杆菌中介导多种重要抗菌药物耐药的基因多位于质粒上，质粒的水平传播促进耐药性在世界范围内的发展。使用PBRT方法，可以对上千种质粒进行分类。IncHI2、IncF、IncI和IncX4等质粒在肠杆菌中介导ESBL、氨基糖苷类、氟喹诺酮类、磷霉素和黏菌素耐药基因的传播，对耐药性发展起着重要的作用，因此，本研究对IncHI2、IncFⅡ、IncI2、IncI1和IncX4这5种重要质粒在安徽某肉鸡场2013年～2018年的流行分布及随年代发展而产生的变化进行研究。
IncHI2质粒是肠杆菌中最流行的质粒型之一，多种耐药基因可以通过转座子、整合子和插入序列等可移动元件插入质粒耐药区中，因此IncHI2质粒通常携带多种耐药基因，例如bla CTX-M、oqxAB、aac(6’)-Ib-cr、floR、mcr-1、fosA3、rmtB等（Fang et al.,2016；Li et al.,2013；Wong et al.,2016a；Yang et al.,2014）。本研究中，IncHI2质粒检出率为32.61％，显著高于其他三种质粒（P<0.05），且比国内其他报道中检出率高（Fang et al.,2016）。可能是由于该养殖场长期使用阿莫西林、头孢类、喹诺酮类和氟苯尼考等多种药物，多种药物的共同筛选使得IncHI2质粒成为该养殖场的优势质粒；而携带多种耐药基因的IncHI2质粒在该养殖场的广泛流行，也可能是该养殖场耐药情况相对严重、多种耐药基因检出率高的原因之一。
IncFⅡ型质粒在该养殖场有较高的检出率，并且从2013年～2018年检出率呈现上升的趋势，尤其是2013年～2014年上升迅速，从8.70％上升至19.28％。该养殖场长期使用阿莫西林、喹诺酮类和氟苯尼考等药物，而IncFⅡ质粒与bla CTX-M、rmtB、oqxAB、floR等耐药基因的传播有关（Deng et al.,2011），这可能是IncFⅡ质粒在该养殖场较为流行并且检出率不断增加的原因。
5全文总结
（1）安徽某肉鸡场大肠杆菌中IncHI2、IncFⅡ、IncI2、IncI1和IncX4质粒均有分布，其中IncHI2、IncFⅡ和IncI2质粒是该鸡场的主要流行质粒。blaC TX-M-1G、blaC TX-M-9G、fosA3、rmtB和mcr-1等重要耐药基因在该鸡场大肠杆菌中分布广泛，检出率均高于20％。
（2）mcr-1基因主要位于IncHI2、IncI2和IncX4三种质粒中，IncI2和IncX4偶尔携带blaC TX-M，而mcr-1-IncHI2往往携带多种耐药基因，如blaC TX-M、fosA3、floR、tetA、oqxAB等。
（3）2017年黏菌素使用政策调整后，mcr-1基因在该养殖场的流行分布和传播特征均发生了改变。
参考文献（略）
