本文是一篇工程硕士论文，本课题以高油酸葵花籽油和棕榈硬脂为原料，筛选出两种价格低廉且催化活性高液体脂肪酶PPL和ANL，探究其催化制备食品专用油脂基料油的可行性。
第一章绪论
1.1 研究背景及意义
油脂在人们的膳食中有着不可替代的重要作用。随着社会的进步，为满足消费者需求，各类食品专用油脂应运而生，主要分为人造奶油、煎炸油、起酥油、冰淇淋用油脂、糖果脂、速冻食品专用油脂等。食品专用油脂的需求量也不断增长。根据中华人民共和国海关总署公开数据，2021年我国天然黄油及人造黄油的进口量高于出口量数倍甚至数十倍，年均需求量高达300万吨[1]，表明以人造奶油为代表的食品专用油脂中的基料油在我国有很大的需求[2-4]。
市售的食品专用油脂基料油多以分提棕榈油、牛油和大豆油为原料采用氢化反应制得，因此反式脂肪酸（TFA）和饱和脂肪酸（SFA）均较高。有研究表明，膳食中的TFA每增加2%，人们患心脑血管疾病的风险就会上升25%[5]，并可能引发老年痴呆症。研究发现，因TFA引起心血管疾病[6,7]、并且死于心血管疾病的人数在全球多达50万以上。另外，膳食中SFA是使血清胆固醇升高的主要脂肪酸，膳食SFA摄入量明显影响血脂水平，从而增加患心血管疾病的危险[8–18]。因此，我国法规（GB 28050-2011）强制性要求在食品标签上注明TFA的含量。在《中国居民膳食指南》（2021版）中指出，成年人每日TFA摄入量不超过2 g。世界卫生组织（WHO）也于2018年5月14日发布“取代”行动指导方案，计划在2023年之前彻底清除全球食品供应链中使用的人造TFA，并且世界卫生组织（WHO）推荐膳食中SFA提供的能量应低于膳食总能量的10%。
在以脂肪为基础的食品专用油脂基料油产品中，硬脂被用来提供一个晶体网络，将液体油和水滴包裹在其间隙内[7,19–21]。由于储藏过程中对物理化学性质和稳定性的要求，选择合适的硬脂是非常重要的。如今棕榈硬脂（PS）（SMP范围在44~58℃[22]）被认为是食品专用油脂生产中最受欢迎的硬脂。这种低成本的植物油在SFA和不饱和脂肪酸（USFA）之间保持良好的平衡，容易形成微小的晶体，在长期储存中非常稳定[23]。酯交换后易形成β'晶型，加入PS可大大改善制品的塑性范围[24–27]，β'晶型是制备食品专用油脂的理想晶型[2]。
1.2 油脂改性技术
食品专用油脂基料油改性技术一般分为分提、氢化和酯交换。由于分提得到的基料油结晶颗粒粗大胆固醇含量较高，不利于人体健康，19世纪末氢化改性技术开始广泛应用于油脂改性，然而氢化会产生严重危害人体健康的TFA。因此，人们对酯交换技术用于制备食品专用油脂基料油进行大量的研究，其主要目的是替代氢化技术[30]，生产零TFA的食品专用油脂基料油。酯交换制备食品专用油脂基料油的工业化生产应用发展前景广阔。
酯交换反应通常指一种酯与脂肪酸（酸解）、醇（醇解）或其他酯类在催化剂作用下，发生酰基交换或脂肪酸分子重新排列生成新甘油酯的过程。它是在分子水平上改变甘三酯（TAG）组成从而改变油脂的熔融性质、晶型、氧化稳定性、粘度等理化性质，而且不会产生TFA，因此该技术已经引起了人们的广泛关注，成为国际研究热点[31]，根据催化过程中所所使用催化剂的类型，酯交换分为化学酯交换和酶促酯交换。
1.2.1 化学酯交换
化学酯交换是一种非定向酯交换，可以分为分子间酯交换和分子内酯交换，不改变天然脂肪酸组成，只是使TAG主干连接的脂肪酸重新分布，最终按概率规则达到反应平衡，因此化学酯交换可获得适宜SMP的饱和与不饱和脂的混合脂肪。化学酯交换一般采用金属醇化物（如甲醇钠）作为催化剂，该方法具有催化剂用量少，生产成本低，工艺技术较为成熟等优点。Martini Soares[32]等利用甲醇钠作为化学催化剂，改变棕榈油和PS的质量比分别进行酯交换，得到了具有不同塑性的改性油脂。但该方法所需反应温度较高，油脂中的有益活性成分容易被破坏，而且对原料要求苛刻，副产物较多且不易分离，后续处理繁琐，会污染环境。
第二章 Pichia pastoris 脂肪酶催化制备低饱和食品专用油脂基料油及其特性分析
2.1 引言
市售食品专用油脂基料油SFA含量一般高于50%，甚至>65%，还含有大量的TFA。研究表明，膳食中的TFA每增加2%，患心脑血管疾病的风险会上升25%[5]，并可能引发老年痴呆。SFA摄入是影响人体血脂水平的重要因素，尤其是对血清胆固醇的影响更加明显，导致动脉粥样硬化等心血管疾病风险[62]。在油脂改性技术中，酯交换因不产生TFA[63]，逐渐被广泛应用于食品专用油脂工业生产。酯交换分为化学酯交换和酶促酯交换。化学酯交换在工业中一般使用金属醇化物（如甲醇钠）作为催化剂，该方法具有催化剂用量少，生产成本低，工艺技术较为成熟等优点。但该方法所需反应温度较高，油脂中的有益活性成分容易被破坏，而且对原料要求苛刻，副产物较多且不易分离，后续处理繁琐，会污染环境等。酶法酯交换具有反应条件温和、原料选择性低、不排放污染物、后处理简单等优点。然而，进口脂肪酶的高成本（如Novozym 435市场价格约18000元/千克）很大程度上限制了我国食品专用油脂基料油生物酶催化制备的发展，严重制约了我国食品专用油脂的加工技术水平。因此，找到一种成本低，操作简单，催化活性好的脂肪酶催化酯交换制备食品专用油脂基料油十分重要。
本章以制备饱和脂肪酸含量低于40%的零反式、低饱和食品专用油脂基料油为目的，选用52℃分提PS和HOSO为原料油，对比探究了国内外9种脂肪酶对酯交换油脂制品SFC和SMP的影响，筛选出一种经济、高效的国产脂肪酶；随后重点探究了酶添加量、反应时间、反应温度关键参数对基料油产品的影响，并利用RSM优化最佳工艺条件，建立反应模型。
2.2 材料与方法
2.2.1 实验材料
固体脂肪含量（SFC）的测定：使用脉冲核磁共振仪（pNMR），按照AOCS Official Method Cd16b-93方法测定固体脂肪含量[64]。将熔融油脂样品放入专用玻璃核磁管中，样品高度3~5 cm，80oC下加热30 min使下样品全部溶解，消除历史结晶记忆；随后在0℃低温恒温槽保温90 min，测其SFC值。之后将样品管由低温到高温，依次放入5~50℃环境中，分别静置30 min后测定对应温度下样品的SFC，每个样品取三个平行样检测，取平均值，相对偏差不大于5%。
滑动熔点（SMP）的测定：根据GB/T 24892-2010，采用开口毛细管法测定油脂的SMP。用毛细管精确吸取10 mm高度的完全熔化的油脂样品，将其至于4o C温恒冰箱静置16 h，随后在温度低于样品SMP8~10℃低水浴中搅拌并加热，使水温缓慢上升，当毛细管中样品由于静水压力而缓慢上升时，记录此刻温度。该温度即为油样的SMP。平行测定4次，取平均值。
第三章 Aspergillus niger 脂肪酶催化制备低饱和食品专用油脂基料油及其特性分析 ....................... 29
3.1 引言 ................................... 29
3.2 材料与方法 ................................. 29
第四章 Pichia pastoris 脂肪酶的固定化及其脂肪酶的固定化及其催化制备低饱和食品专用油脂基料油 ......... 46
4.1 引言 .................................. 46
4.2 材料与方法 ........................ 46
第五章 Aspergillus niger 脂肪酶的固定化及其催化制备低饱和食品专用油脂基料油 ................... 62
5.1 引言 .................................... 62
5.2 材料与方法 ................................. 62
第五章 Aspergillus niger 脂肪酶的固定化及其催化制备低饱和食品专用油脂基料油
5.1 引言
前章利用环氧基树脂ES-108B有效固定了液体酶PPL，提高酶的催化性能和重复利用性，并证明了环氧基树脂与脂肪酶通过氢键共价结合能够有效改善游离脂肪酶缺点，实现了易分离、可重复利用、酶催化活性保留率高的目的。这是因为氢键作为一种温和的相互作用力，最大程度地保留了脂肪酶的天然构象[102]，从而使脂肪酶与底物之间的亲和力不被破坏。
因此在前三章实验的基础上，对液体酶ANL进行固定化研究。通过筛选6种树脂载体得到固定游离脂肪酶的最佳树脂载体LX 1000EP，利用FT IR、CLSM、凯氏定氮仪和酶标仪等分析固定化酶LX 1000EP，并进行回收利用性进行研究。采用响应面实验对固定化酶EP-ANL催化酯交换制备食品专用油脂基料油的条件（酶添加量、时间和温度）进行优化，并对酯交换产物的热性质、TAG组成、晶型和晶体形态进行分析表征。
结论
本课题以高油酸葵花籽油和棕榈硬脂为原料，筛选出两种价格低廉且催化活性高液体脂肪酶PPL和ANL，探究其催化制备食品专用油脂基料油的可行性。为了提高游离脂肪酶PPL和ANL的催化性能和降低固定化酶的生产成本，本课题研究了低成本的国产树脂共价结合法固定游离脂肪酶的方法。
（1）本实验筛选出一种价格低廉且催化活性高的国产液体酶Pichia pastoris脂肪酶（PPL），可替代昂贵的进口脂肪酶用于食品专用油脂基料油的开发制备。通过单因素和响应面（RSM）优化得到最优的实验条件为：反应时间25 min，酶添加量
