本文是一篇临床医学论文，我们发现OCT能较好的区分口腔正常组织和鳞癌组织，有良好的潜力引导OSCC手术切除，但这仍需进一步的研究。已经开发的便携式OCT可以用于引导OSCC手术切除的动物实验，此外灰度值单一指标，可能会限制OCT的使用，仍需发现更多可靠的指标，使得OCT能通过多指标来评估肿瘤切缘。
第一部分 OCT 在口腔癌诊断中的研究
1.1 前言
口腔癌是一类发生于口腔的独特类型癌症，已被确定为全球最常见的恶性肿瘤之一[1]，其中OSCC约占口腔癌的90%。口腔癌的恶性程度高，患者5年平均生存率低于60%[5]。口腔癌的治疗主要通过手术治疗，手术过程中完整切除原发灶至关重要。外科医生在术中主要根据对肿瘤的视诊和触诊来决定肿瘤切除范围，这不仅对医生个人经验要求极高，而且容易造成阳性切口[34]。虽然可以使用术中快速冰冻病理来评估手术切缘，但术中冰冻病理只能研究切缘的一小部分，这容易造成假阴性[17]。因此需要找到一种便捷、精准、快速判断肿瘤边界的新技术，术中指导肿瘤切除。
光学相干断层扫描是一种非侵入性的实时诊断技术，可以根据组织之间光学特性的差异提供生物结构的横截面图像[35]。目前，OCT主要分为TD-OCT和FD-OCT两种：TD-OCT是把在同一时间从组织中反射回来的光信号与参考臂反射回来的光信号叠加、干涉，然后成像[36]。而FD-OCT的特点是参考臂固定不动，通过改变光源光波的频率来实现信号的干涉，FD-OCT相对TD-OCT而言，因改善了系统灵敏度显著提高了成像速度[37]。FD-OCT又可细分为SD-OCT[38]和SS-OCT[39]，两者区别主要是成像过程中使用了不同技术。SD-OCT利用高解像度的分光光度仪来分离不同波长的光波，SS-OCT利用波长可变的激光光源发射不同波长的光波。由于癌变组织具有与健康组织不同的光谱特性和结构，外加OCT能提供高分辨率（10-20μm）的检测图像和足够的组织穿透深度，使得OCT在早期癌症的诊断和肿瘤治疗的检测中有可观的前景[40]。
本部分研究主要通过对OCT图像的灰度值定量以及OCT图像与HE图像的相似性，探索OCT能否用于鉴别口腔癌症组织与正常组织，辅助肿瘤切缘评估。
1.2 材料与设备
1.2.1 主要仪器
CM 1900冷冻切片机，Leica，德国；
DMI 4000B光学显微镜，Leica，德国；
HSO-3000光学相干层析成像仪，深圳市生强科技有限公司，中国。
EL104电子天平，Mettler Toledo，瑞士；
二氧化碳培养箱，Thermo Scientific，美国；
Milli-Q Academic纯水系统，Millipore，美国；
生物安全柜，Thermo Scientific，美国；
高压灭菌锅，Hirayama，日本；
细胞电动移液枪，Eppendorf，德国；
VMR小动物专用吸入麻醉机，Matrx，美国；
TGL-16C离心机，Anke，美国。
第二部分 原位舌鳞癌裸鼠模型构建
2.1 前言
多种动物已被研究用于建立口腔鳞癌模型，包括仓鼠、大鼠、小鼠、狗等[42–44]。早在1954年，研究人员就用化学药物在仓鼠脸颊袋诱发SCC[45]，仓鼠SCC与人OSCC表现有许多相似之处，例如形态、组织学以及肿瘤的浸润转移等特点[46,47]。然而，该模型也有其缺陷，例如人缺乏脸颊袋以及仓鼠的淋巴系统与人类的淋巴系统有很大差异性等[48]。此外，非鼠类动物也已用于OSCC的研究，例如猫和狗[44]。这类大型动物具有更强的操作性，更能模拟外科手术。但是用于研究猫和狗的试剂较少，使用这些模型难以解决物种特异性的药物代谢和溶解性问题，并且这些动物往往价格昂贵[49]。啮齿动物中，除了仓鼠，大鼠和小鼠也广泛应用于OSCC的建模中。其中由于几乎没有免疫缺陷或是基因工程的大鼠，而小鼠又价格较低，且具有与人类高度相似的生理以及分子特性[50]，使得小鼠成为最常用的OSCC建模动物。
现如今，小鼠OSCC模型构建的方法主要为三类：化学致癌物诱导、移植瘤移植以及基因工程[51]。其中化学致癌物诱导主要使用4NQO，诱导途径包括局部涂抹以及添加到小鼠的饮用水中两种，可使用的小鼠类型包括C57BL/6、BALB/c以及SWR等[52]。4NQO诱导的小鼠模型反映了人类OSCC从发育异常到侵袭的多阶段动态致癌性。随着诱导的时间进展，口腔病变组织（主要为舌部）的病理阶段经历了上皮增生、不典型增生、原位癌和浸润性鳞状细胞癌[53]。此模型的特征之一是，并非所有的小鼠都会同时出现相同的病变，并且在一只小鼠的舌头上可以看到多种病变[53,54]。总之，4NQO诱导的OSCC小鼠模型似乎是研究OSCC诊断的最佳可用模型[55–57]。然而，此模型构建周期较长，需要28周左右，因此不适合实验时间不太充裕的研究者。此外，该模型由于其转移和骨侵袭的可能性低，因此在恶性肿瘤的侵袭和转移研究中的应用有限。
2.3 实验方
2.3.1 细胞实验
（1）细胞复苏
将冻存细胞从液氮中取出后，在37℃水浴锅内不断摇动促进其融化；移入15ml离心管中，加入10ml预热的DMEM完全培养基，轻轻吹匀，离心（1000rpm*5min），弃上清液；加入10ml的DMEM完全培养基，轻轻吹打，接种于培养皿中；在37℃、5%CO2的细胞培养箱中培养。
（2）细胞传代
细胞长至约铺满瓶壁90%左右时，弃培养基；加入5PBS液，轻轻摇晃，待PBS覆盖整个瓶壁后弃去；继而加２ml胰酶于37℃培养箱消化3-5min，于显微镜下观察，直至细胞形态变圆、细胞间隙明显,加入含血清的完全培养基终止消化；离心（1000rpm*5min）后弃胰酶及培养液，加入新培养基重悬细胞，再根据细胞数量，将细胞悬液分传到2-３瓶新的培养皿中培养。
（3）细胞冻存
细胞长至约铺满瓶壁90%左右时，弃培养基；加入5ml的PBS液，轻轻摇晃，待PBS覆盖整个瓶壁后弃去；继而加２ml胰酶于37℃培养箱消化3-5min，于显微镜下观察，直至细胞形态变圆、细胞间隙明显加入含血清的完全培养基终止消化；离心（1000rpm*5min）后弃胰酶及培养液，加入适量配制好的冻存培养液，用吸管轻轻吹打使细胞均匀；将细胞分装入冻存管中，放入-80℃冰箱或液氮中冻存。
第三部分 OCT 在舌鳞癌动物模型诊断中的研究………………27
3.1 前言..........................27
3.2 材料与设备....................27
3.3 实验方法...........................27
总结与展望………………33
第三部分 OCT在舌鳞癌动物模型诊断中的研究
3.3 实验方
3.3.1 实验小鼠分组
基于第二部分平均3天的成瘤时间，18只BALB/c裸小鼠随机分为6组：空白对照组、实验组A（1天）、实验组B（2天）、实验组C（3天）、实验组D（4天）、实验组E（5天），每组小鼠3只，在注射肿瘤悬浮液前及注射后第1、2、3、4、5天分别处死各组小鼠，解剖出舌组织，OCT成像，成像后行HE染色。
3.3.2 OCT成像方法
安乐处死小鼠，解剖小鼠舌组织(如图8A所示)，使用生理盐水冲洗3遍，由于造模时，肿瘤悬浮液主要注射于舌中部，在此基础上，为了方便成像，并去除影响结果的舌根组织，切除舌尖与舌根，剩余舌组织一分为二（如图8B所示），标记为组织1与组织2（如图8C所示），置于载玻片上放入OCT成像台进行成像，所有组织均为靠近舌尖的面朝上成像。调整光源，使光源对焦于组织上，而后从前至后依次成像，每个离体舌组织成像3次，每个成像距离间隔1mm（如图8D所示）,成像后组织行HE染色。
临床医学论文参考
总结与展望
原发灶的完整切除一直是外科医生关注的热点问题，临床上依据视诊及触诊来评估手术切缘对外科医生的要求极高，且容易导致阳性切口，虽然可以通过术中切缘冰冻病理对切缘进行评估，但术中冰冻病理只能研究切缘的一小部分，这容易造成假阴性。本课题基于此问题，通过人体标本和原位舌鳞癌动物模型，评估OCT能否鉴别口腔鳞癌组织和口腔正常组织，探究OCT能否应用于临床指导口腔鳞癌手术切除。
本课题一共分为三部分内容：第一部分通过对人体口腔鳞癌组织和正常组织进行OCT扫描，并行病理HE验证，发现OCT图像与HE图像高度相似，并且鳞癌OCT图像的灰度值显著高于正常组织OCT图像的灰度值；第二部分主要为构建原位舌鳞癌动物模型，用于第三部分研究；第三部分主要基于前两部分的研究，通过对大量裸鼠舌鳞癌组织和正常组织进行OCT成像和HE染色，发现OCT图像灰度值为48时，能较好区分裸鼠舌鳞癌组织和正常组织，以OCT图像灰度值为48作为OSCC检测的标志物，敏感度为98.6%，特异性为80.1%。
基于以上研究，我们发现OCT能较好的区分口腔正常组织和鳞癌组织，有良好的潜力引导OSCC手术切除，但这仍需进一步的研究。已经开发的便携式OCT可以用于引导OSCC手术切除的动物实验，此外灰度值单一指标，可能会限制OCT的使用，仍需发现更多可靠的指标，使得OCT能通过多指标来评估肿瘤切缘。
参考文献（略）
