本文是一篇外科学论文，本研究属于回顾性研究，对TCGA数据库中乳腺癌数据集进行了挖掘和分析，并联合ExoBCD数据库中的外泌体相关基因进行分析，构建了一个两基因的用于预测TNBC患者预后的预测模型，并以本中心的数据集作为外部验证，证明了模型的性能。
第2章 综述
2.1 前言
截止2020年，乳腺癌已经成为女性最常见的癌症，估计每年新发病的人数超过230万[1]。乳腺癌的癌症死亡率一直居于女性所患癌症的前列[4]，三阴性乳腺癌约占乳腺癌的15%-20%[5]。雌激素受体和孕激素受体是乳腺癌细胞中常见的受体类型，它们可以通过结合雌激素和孕激素来促进癌细胞的增殖，而HER-2是一种生长因子受体，过度表达或异常激活HER-2会导致乳腺癌细胞的异常增殖。三阴性乳腺癌即是ER、PR和HER-2表达皆为阴性的乳腺癌亚型，这使得TNBC相对于其他乳腺癌亚型缺乏治疗靶点，无法通过常规的内分泌药物及针对HER-2的靶向药物来进行治疗，治疗手段较为单一。TNBC的肿瘤细胞往往具有高度增殖能力和转移倾向，TNBC患者具有较高的复发率和较差的预后[6]。
外泌体是几乎所有类型的真核细胞都分泌的天然纳米级膜囊泡，其内含有生物活性分子，如蛋白质、mRNA、DNA 和代谢产物等[7]。大量研究表明，外泌体具有细胞通讯能力，并因其良好的生物相容性和低免疫原性而在药物递送方面具有优势[8]。外泌体中所含的具有生物活性的物质，如miRNA、lncRNA和circRNA等，在癌症中具有多种功能。作为一种信使载体，外泌体的一项任务是将各种活性生物分子从宿主细胞传送到受体细胞。这是由于外泌体源自细胞的膜结构，因此很容易与另一个细胞结合，并通过膜融合将其内容物释放到另一个细胞中。通过调节mRNA，miRNA影响许多重要的细胞过程和癌细胞的发展，如细胞增殖、迁移、侵袭和转移。最近，在TNBC中发现了外泌体的失调，这与TNBC患者的临床病理特征和预后有关。在生物学上，外泌体及其释放的内容物可以改变受体细胞的生理和病理机制。此外，外泌体递送系统的主要优点还包括特异性、安全性和生物稳定性。通过细胞表面的配体-受体相互作用和内吞作用将化疗药物通过工程外泌体选择性地递送到TNBC细胞中，从而消除耐药性，这很有可能彻底改变 TNBC 的治疗方案并克服目前的治疗困境[9]。
2.2 三阴性乳腺癌的分型及发病机制
目前，针对三阴性乳腺癌的分型方式有很多种，常见的如Lehmann分型、Burstein分型及复旦分型等。2011年，Lehmann及其团队对587名TNBC患者的肿瘤样本进行了基因表达谱分析，将TNBC划分为BL1、BL2、M、MSL、IM和LAR等六个亚型[10]。研究发现，在BL1亚型中，细胞周期调节和DNA修复相关基因异常表达，包括MYC、PIK3CA、CDK6等的高表达，以及BRCA2、PTEN等基因的低表达。BL2亚型则显示出EGFR、MET等信号通路的异常激活。M亚型具有肉瘤或鳞状上皮细胞特征，展现出细胞迁移相关信号通路的活跃性[11]。MSL亚型细胞增殖相关基因表达较低，但干细胞相关基因表达较高。IM亚型免疫细胞相关基因富集，包括Th1/Th2通路、NK细胞通路等。LAR亚型虽不表达ER，但激素相关信号通路显著活跃，且雄激素受体（Androgen receptor，AR）高表达，其mRNA表达水平显著高于其他亚型。免疫组化检测到AR和下游代谢标志物的高表达[12]。2015年，Burstein等人研究了198例患者的样本，通过DNA和RNA分析，并根据已确定的潜在靶点进一步分为四种亚型[13]：激素受体阳性亚型（LAR）、间充质亚型（MES）、基底样免疫抑制亚型（BLIS）和基底样免疫激活亚型（BLIA）。其中，BLIS亚型肿瘤预后最差，BLIA亚型肿瘤预后最好。2016年，Liu等人使用人类转录组微阵列分析了165个TNBC样本的转录组谱系，最终结果将TNBC分成了4种亚型[14]：IM、LAR、MES、BLIS，其中，BLIS亚型的患者较其他亚型患者具有更差的无复发生存期（Recurrence-free survival，RFS）。当然，目前也尚存其他一些根据肿瘤微环境和免疫特征的差异所分的亚型，这其中包括Saleh等人鉴定出了4种基质轴[15]，其具有与TNBC微环境相关的分子和临床特征，将这些基质轴得分结合起来即生成了一个新的TNBC亚型分类方法，其揭示了不同基质轴之间具有独特的预后相关性。
第3章 资料与方法
3.1 研究分析流程
本研究采用生物信息学分析方法，分析了与外泌体相关的影响预后的三阴性乳腺癌差异表达基因。流程图如图3.1所示。
首先在TCGA数据库中下载乳腺癌数据集，筛选后得到三阴性乳腺癌数据集，包括肿瘤样本和正常组织样本的基因表达谱和临床信息。对以上三阴性乳腺癌肿瘤样本和正常组织样本基因进行差异分析，得到三阴性乳腺癌差异表达基因，继续行单因素COX回归分析，得到预后相关TNBC差异表达基因。然后，在ExoBCD数据库中下载得到与外泌体相关的基因，对外泌体相关基因和预后相关TNBC差异表达基因进行交集分析，获得外泌体相关预后基因。对预测基因进行基因富集分析，探究其可能涉及的生物途径。
使用LASSO回归分析和多因素COX回归分型构建风险评分预测模型。使用K-M生存曲线、ROC曲线评估模型预后价值。对高低风险组进行免疫浸润分析，评估免疫细胞和免疫功能在两组间的差异。对本中心数据集进行风险评分预测模型的外部验证，证明模型的有效性。
通过单因素和多因素COX回归分析，将风险评分确定为独立预测因子，与T分期、N分期、M分期结合作为参数构建生存预测的诺莫图。使用ROC曲线、DCA曲线及校准曲线，验证了诺莫图良好的预测性能和临床适用性。
3.2 数据集的获取
3.2.1 公共数据库数据集的获取
从TCGA数据库（ https://portal.gdc.cancer.gov/）获取乳腺癌数据集，其中包括了1217例乳腺癌样本和正常组织样本。从中筛选出113例三阴性乳腺癌样本和113例正常组织样本的，并获得基因表达谱和临床信息。
从ExoBCD数据库（https://exobcd.liumwei.org/）下载得到外泌体特征相关基因共121个。
以上公共数据库来源信息不存在伦理冲突问题，未行伦理审批。
3.2.2 本中心数据集的获取
收集从2021年1月至2023年12月就诊于吉林大学第一医院乳腺外科的共70例TNBC患者样本，进行全RNA转录组测序，获得基因表达谱。详细查阅既往病历资料，获取患者的临床资料。通过门诊复查随访及电话随访等方式获取准确的患者生存信息，记录从确诊至随访日期的OS。本研究已通过吉林大学第一医院伦理委员会伦理审批，所有患者已签署知情同意书。
3.3 差异表达基因分析
对TCGA数据集使用R语言 DESeq2”包分析其中113例TNBC肿瘤样本和113例正常组织样本两组基因差异，|log2 fold change|> 1和校正后 P < 0.05在本研究中视为差异表达基因。绘制差异分析的火山图以可视化。
对上述差异表达基因使用R语言 survival”包进行单因素COX回归分析，P < 0.05的基因被视为预后相关差异表达基因。
第3章 资料与方法 ........................... 22
3.1 研究分析流程 ......................... 22
3.2 数据集的获取 ......................... 24
第4章 结果............................... 27
4.1 差异表达且具有预后价值的外泌体相关基因 ............ 27
4.2 构建及验证三阴性乳腺癌预后模型 .................... 30
第5章 讨论........................ 40
第5章 讨论
三阴性乳腺癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一，与其他乳腺癌亚型相比预后较差。目前TNBC的治疗主要包括早期术前新辅助化疗、手术治疗和辅助化疗。然而。由于缺乏靶向受体，TNBC的治疗在临床上仍是一项具有挑战性的工作。准确的预后是精准医学在进行风险分层和制定最佳治疗方案时的关键因素。因此，必须建立一种新型生物标志物来预测TNBC的预后并提供可靠的治疗目标。
在大多数细胞类型中，外泌体在细胞间通信中发挥重要作用。外泌体在抗原呈递、免疫调节、逃避细胞凋亡、耐药性、逃避免疫监视等多种生物学功能方面都有所研究。此外，一些恶性肿瘤细胞分泌的外泌体被认为是调节血管生成、免疫和转移以促进肿瘤发生的关键。一些研究报告称，外泌体在体外容易获得且稳定。因此，研究人员认为外泌体在恶性肿瘤的早期诊断和治疗中具有巨大潜力[142]。Gonzalez Villasana等人通过分离乳腺癌和非癌症患者外泌体中的 miR-145、miR-155和miR-382证实乳腺癌患者的外泌体浓度较高，证明了外泌体浓度与恶性乳腺肿瘤状态之间的相关性[143]。越来越多的研究揭示了外泌体作为乳腺癌前瞻性新治疗方法的重要作用。癌症患者体液中某些外泌体生物标志物表达水平的改变表明外泌体可作为诊断和预后监测的早期标志物发挥作用。一项研究表明，外泌体miR-101浓度的降低与淋巴结阳性癌症有关，在三阴性乳腺癌、激素受体阴性乳腺癌患者中，miR-373水平显著上调[144]。通过比较治疗前和治疗后的外泌体，并与临床效果和病理结果相关联，我们能够预测治疗反应和患者预后。综上所述，外泌体作为乳腺癌早期诊断和评估
