本文是一篇工程论文，本论文通过对四种人群33位健康志愿者粪便分离纯化、形态观察、16S rD NA测序，筛选出1株丁酸梭菌，来源于河南省内96岁男性长寿老人志愿者，将其命名为Clostridium butyricum B-3。
1 绪论
1.1 丁酸梭菌
1.1.1 丁酸梭菌的概述
丁酸梭菌属于梭状芽孢杆菌，又称酪酸梭菌，为严格厌氧的革兰氏阳性芽孢杆菌。其菌落形态呈略不规则的圆形，表面光滑，中部略凸起，色泽多为白色或奶油色；菌体细胞直立，中部稍隆起，两头圆钝，呈梭形；能生成芽孢，孢子卵圆，端生或次端生。
丁酸梭菌为发酵细菌，主要对肠道内未完全吸收的膳食纤维和碳水化合物进行发酵，主要产丁酸，故而得名。丁酸梭菌作为一种厌氧菌对氧气具有高度敏感性，不同菌株对厌氧条件存在差异性。研究表明部分菌株在有氧的环境中处于休眠状态，培养坏境氧气含量极低或几乎不存在时生长良好，原因是细胞中缺乏产生能量的呼吸链，在有氧状态下，会造成细胞死亡[1]。
1.1.2 丁酸梭菌的来源
丁酸梭菌存在于多种环境中，大多数都是极其严格的厌氧细菌，属于梭状芽胞杆菌簇IV和XIVA[2]。其最早在婴儿体内被分离得到，目前据统计仅在10-20%的人类肠道中被发现，人源性丁酸梭菌的筛选仍是目前的难点问题[3-4]。由表1-1可知，目前筛选得到的丁酸梭菌可分类为人类来源、动物来源和其他环境来源，其中动物来源获取丁酸梭菌较多，而对人源性丁酸梭菌的筛选主要集中在健康成人，人群选择上未有覆盖全面性。长寿老人作为一类特殊人群，其肠道菌群存在特殊性，是否能从该群体中筛选出丁酸梭菌，进一步研究长寿老人源丁酸梭菌的性质，为丰富益生菌种类，研究长寿机制奠定基础。
1.2 肥胖的研究进展
1.2.1 肥胖的概述
预计到2035年，全球超重患病人数将达到40亿人，而肥胖患病人数接近20亿，肥胖已发展成为威胁全球公共卫生系统的全球性疾病。2000年，世界卫生组织将超重（overweight，OW）和肥胖症（obesity）定义为异常或过多的身体脂肪堆积到可能损害健康的疾病，并强调以体重指数（BMI）为肥胖的实际定义基准[67]。BMI（BMI=体重/身高2（kg/m2））作为衡量OW / obesity的科学指标。根据中国肥胖问题工作组制定的标准，将BMI指数范围在18.5-24.9 kg/m2设为健康；将BMI指数范围在25-29.9 kg/m2设为超重；将BMI指数范围在≥30 kg/m2设为肥胖症，但BMI指数不能避免个体特异性差异[68]。
肥胖的本质是由于热量摄入过多或能量消耗减少或两者都有导致的能量失衡。肥胖的特征是脂肪组织过度积聚，导致慢性低级别炎症反应增加[69]。它是一种多因素疾病，由环境和遗传因素等综合因素造成，如饮食不均衡、肠道微生物群功能失调、全身性低度炎症、代谢紊乱、遗传和熬夜都可能导致肥胖，反之肥胖还会引发一系列的并发症[70-73]。
1.2.2 肥胖的干预方法
目前过多的高脂饮食和加工食品破坏了肠道微生物的平衡，从而增加肥胖的发生风险，缺乏运动，社会压力和睡眠不足等因素交织，导致肥胖症增长趋势难以逆转，采取多种干预措施以预防或减轻肥胖负担迫在眉睫。目前最常见的肥胖干预手段为药物治疗、手术治疗和饮食治疗，这些干预措施可以帮助人们控制体重，降低肥胖对健康的影响[74]。
2 丁酸梭菌的分离与鉴定
2.1 引言
丁酸梭菌作为严格的厌氧益生菌，因具有产芽孢、产丁酸等独特的生理特性，近年来成为研究热点[90]。目前，关于丁酸梭菌及其产品的研究较少，只有日本米雅利桑制药株式会社研发的丁酸梭菌MIYAIRI 588和由青岛东海药业研发的丁酸梭菌阿泰宁作为益生菌活菌制剂被广泛应用[91-92]。丁酸梭菌在人和动物肠道内、自然环境中被发现，但目前对丁酸梭菌的研究多集中在动物源性的筛选和养殖业的发展，对人源性的筛选和应用研究较少，人源性益生菌表现出良好的适应性，能够在体内发挥益生作用，促进人体生长，所以筛选人源性丁酸梭菌具有重要意义。
传统的细菌分离与鉴定方法主要依赖于细菌形态、生理特性以及生态习性等方面的特征，如细菌大小、形状、芽胞形成能力、培养基营养要求等。其中最常用的分类方法是伯杰氏分类系统，该系统的缺点是某些特性的测定精度差，且无法表达分离物间的系统发育关系等。为了解决伯杰氏分类系统的局限性，研究人员开始使用分子生物学方法进行细菌分类鉴定。其中最常用的是16S rDNA序列分析，此方法是通过分析细菌基因组的16S rRNA基因序列，以推测菌株之间的亲缘关系。由于16S rRNA基因在所有细菌中均有存在，且不同细菌的16S rRNA基因序列差异较大，因此16S rD NA序列分析具有较高的鉴定精度和可靠性[93]。
本章在厌氧富集和常规分离纯化单菌落的基础上，采用菌落形态、革兰氏染色、生理生化和16S rDNA序列分析相结合的方法，对收集的粪便样品进行丁酸梭菌的分离与鉴定，进一步对鉴定成功的丁酸梭菌进行生长特性的测定。
2.2 材料与仪器
2.2.1 实验材料
粪便样品收集于全国地区，筛选人群均健康，在采样前一个月内，所有志愿者均未服用任何抗生素类药物。采用无菌工具取少量样品放入无菌取样袋，低温即时带回实验室，并置于-20℃保存。
征集志愿者要求如下：
（1）长寿老人：年龄在90岁以上；言语动作能力正常，血糖、血脂、血压正常；没有帕金森综合征、糖尿病、心脏病、阿尔兹海默症、癌症等重大疾病。（2）健康男性：年龄在20-25岁，身体健康。（3）健康女性：年龄在20-25岁，身体健康。（4）健身人群：三年以上健身基础，肌肉含量较高者。
辅以参考其饮食习惯，如下：
（1）全素：以米面食品为主食、以豆类、水果蔬菜为辅；几乎无肉、奶、蛋等。（2）多素：以米面食品为主食、以豆类、水果蔬菜为辅；少量肉、奶、蛋等。（3）多肉：肉类、蛋类和奶类为主食，少量米面食品、豆类、水果蔬菜等。（4）饮食均衡：大约一半食品为米面食品、豆类、水果蔬菜等素食，另一半为肉、奶、蛋等
3 丁酸梭菌B-3 的生物学特性及体外降脂功能研究 ......................... 25
3.1 引言 ........................................ 25
3.2 材料与仪器 ................................ 25
4 丁酸梭菌B-3 发酵工艺优化 .......................... 43
4.1 引言 .................................. 43
4.2 材料与仪器 ................................ 43
5 丁酸梭菌B-3 对高脂膳食小鼠降脂和肠道菌群的作用 ................. 55
5.1 引言 ........................... 55
5.2 材料与仪器 ............................ 55
5 丁酸梭菌B-3对高脂膳食小鼠降脂和肠道菌群的作用
5.1 引言
目前，由于饮食结构的改变，肥胖已成为全球人群普遍的健康问题[147]。肥胖症多由长期摄入高脂肪和高胆固醇食物引起的机体脂代谢异常所致，其本质为脂肪过度堆积[148]。与包括心血管疾病、Ⅱ型糖尿病（T2DM）和非酒精性脂肪性肝病等在内的多种疾病密切相关[149-150]。多数研究表明，肠道微生物区系在肥胖症的进展中起着关键作用，提高肠道菌群的菌种多样性和菌群丰富度成为预防/治疗肥胖中的关键切入点[151-153]。肥胖患者的肠道菌群多失衡[154-155]，而肠道菌群失调又与肥胖等慢性代谢疾病的发展有关[156-158]。
近年来，微生态学家发现益生菌群中的乳酸菌有一定的降脂能力，且国内外许多研究都证实了乳酸菌能够对高脂膳食诱导的机体脂代谢异常有显著的改善作用[159]。丁酸梭菌作为二代益生菌，其对急慢性腹泻、肠易激综合症等胃肠病的治疗作用已经得到充分的证实，但其对肥胖的预防/缓解作用及对肠道菌群的影响的相关研究较少。
前一章的研究已证明Clostridium butyricum B-3具有良好的体外降脂能力，为进一步评价其在动物模型体内的降脂效果，本章对高脂膳食小鼠施加不同剂量的C. butyricum B-3活菌剂干预，以体重、肝脏组织病理学、短链脂肪酸、血脂代谢及肠道菌群为指标，探究其对高脂膳食小鼠减肥降脂和肠道菌群的影响。
结论与展望
结论
（1）本论文通过对四种人群33位健康志愿者粪便分离纯化、形态观察、16S rD NA测序，筛选出1株丁酸梭菌，来源于河南省内96岁男性长寿老人志愿者，将其命名为Clostridium butyricum B-3。
（2）以商业化菌株Clostridum butyricum MIY588作为阳性对照，以生长特性、产丁酸特性、模拟消化道耐受性、抗生素敏感性、基础产酶特性和体外抗氧化能力为指标，对C. butyricum B-3进行生物学特性评价：发现C. butyricum B-3 OD600值稳定在1.5左右，pH值稳定在4.3左右；其丁酸产量高，最大量约为1.2 g/L；经过连续胃肠液模拟消化和梯度胆盐浓度消化后其存活率仍大于80%；对青霉素、氨苄西林、诺氟沙星、环丙氟哌酸、庆大霉素、阿米卡星具有敏感性，对红霉素、头孢唑林等具有耐药性；可高效产生淀粉酶、纤维素酶和蛋白酶；C. butyricum B-3羟自由基清除能力、DPPH自由基清除能力和还原力均优于阳性对照菌株。C. butyricum B-3体外胆酸盐降解能力、胰脂肪酶抑制能力和
