巨大的市场需求促使研究人员展开了大量针对 C6 醛生产的研究。一般而言，通过化学合成的手段获得大量稳定的 C6 醛是最简单也是最为直接的方法。然而在食品领域，天然手段得到的添加剂或香精香料产品更容易受到消费者的青睐。就同一种产品而言，天然产品的市场销售价格远高于化学合成品[5–6]。天然清香型香精香料的传统制备方法是直接从植物原料中提取获得，例如薄荷精油的蒸馏。但是这一方法目前也面临着诸多问题：（1）天然植物原料中己醛、2(E)-己烯醛、3(Z)-己烯醛等目标化合物的含量极低；（2）大规模的工业化提取容易受到气候条件以及植物病虫害等问题[7]的限制；（3）提取过程中会产生较多的工业废料而造成环境污染。这些问题都使得从植物原料中提取这些化合物成分的成本过高。按照欧洲和美国的相关法规，通过生物技术途径合成的产物也可以称为天然产物[8]，从而使得模拟植物体内的代谢途径，酶法催化游离不饱和脂肪酸的氧化反应及其随后的降解反应以制备己醛、己烯醛等 C6 醛类的方法具有很强的吸引力。
......
第二章 膜结合态HPL与羟基磷灰石固定化HPL的研究
2.1 前言
作为一种廉价易得，并且可以重复使用的材料来说，羟基磷灰石（CHT）在酶固定化以及蛋白纯化过程中都有着非常广泛的应用[94]。在酶的固定化领域，由于其刚性的结构以及较好的稳定性，CHT 被认为是非常适合于酶固定化的一种无机材料。目前为止，已经有许多种酶，包括葡萄糖蔗糖酶[95]以及麦芽糊糖精磷酸化酶[96]被成功固定于 CHT上。而在生物色谱应用的研究领域，CHT 柱已经被成功用于 HPL 的分离纯化[97, 98]。纯化过程中较高的酶活收率表明 HPL 与 CHT 的相互作用较为温和，不会导致酶活的大量丧失。同时，按照蛋白质色谱纯化技术即为酶固定化的一种特殊情况这一理念，CHT-HPL也可以被看作一个简单的固定化酶。因此，本章尝试将 M-HPL 与 CHT-HPL 视为两种简单的固定化酶。对比它们各自的蛋白载量、固定化 HPL 活力、最适反应 pH、最适反应温度、热稳定性、操作稳定性以及动力学参数等方面的差异，以更好地理解酶和载体的相互作用对 HPL 固定化的影响，并为后面进一步选择合适的固定化载体提供依据。2.2 实验材料和设备
新鲜红叶苋菜购于无锡华润万家超市。脂肪氧合酶（LOX1）提取于万德福工业豆粕。羟基磷灰石（CHT）购于伯乐公司。亚油酸（99%）、亚麻酸（99%）、己醛（98%）、2(E)-己烯醛（98%）购于上海 Sigma-Aldrich 公司。二硫苏糖醇（DTT，Dithionthreitol）购于默克化学制品公司。其他试剂诸如蔗糖、曲拉通 X-100、三羟基氨基甲烷（Tris）、聚乙烯吡咯烷酮 K-30（PVP K-30）等均为化学分析纯，购于国药集团化学试剂有限公司。第三章 仿叶绿体膜疏水性的壳聚糖复合水凝胶固定化 HPL................23
3.1 前言................. 233.2 实验材料与设备.................................... 23
第四章 仿叶绿体尺寸的纳米磁性微球固定化 HPL.......................37
4.1 前言.............. 37
4.2 实验材料和设备.................................................. 37
第五章 固定化 HPL 连续化制备 C6 醛.....................51
5.1 前言............. 51
主要结论与展望
一、主要结论
1、相比较于 CHT-HPL，M-HPL 的蛋白含量和活力比较高，分别可以达到64.67±0.4 mg/g 以及 45.27±0.3 U/g；另外，叶绿体膜的结合对 HPL 最适反应条件及其他酶学性质的影响较小。然而，M-HPL 的热稳定性、操作稳定性以及对产物 2(E)-己烯醛的耐受性较差。2、载体的疏水性对于 HPL 的固定化非常重要。模拟叶绿体膜表面疏水性而设计合成的 CCH-HMDA 是一种较为适合 HPL 固定化的载体材料。固定化过程中酶和载体之间疏水性间隔臂的引入显著增大了 CCH-HMDA-HPL 的蛋白载量以及固定化酶活力，使其分别可以达到 6.157±0.16 mg/g 及 7.49±0.19 U/g。另外，相比于 CHT-HPL 和 M-HPL，CCH-HMDA-HPL 由于其更为牢固的共价结合固定化方式而具有更好的热稳定性、操作稳定性、储藏稳定性以及对底物和产物的耐受性。使用 CCH-HMD-HPL 制备 C6 醛，己醛和 2(E)-己烯醛的单位体积产量分别可以达到 1987.9±67.9 mg/L 以及 1374.8±51.8mg/L，单位酶活产量可以达到 1.92±0.07 mg/U 以及 0.344±0.01 mg/U。二、展望
本文借鉴HPL在植物体内天然的存在状态进行HPL固定化载体的理性设计与制备，并对所得到的固定化 HPL 酶学性质及其稳定性进行了全面的研究。最后将所得到的固定化酶应用于 C6 醛的连续化生产中并取得了较好的结果。但是，就 HPL 的固定化研究而言，在以下方面仍然有待深入研究：1、由于 HPL 的不稳定性以及缺乏对 HPL 结构信息的了解，目前还无法深入地研究HPL 的固定化并对其稳定化机理做出解释。如果能对其酶结构和构象展开深入的研究，将有利于对 HPL 固定化的进一步研究。2、固定化结合填充床柱式反应器能够在保留较高 HPL 活力的基础上提高 HPL 的稳定性，也能够在一定程度上减弱反应过程中出现的底物抑制和产物抑制，但不能从根本上解决这一问题。另外，对于这一问题的解决，已经有许多研究人员从分子生物学的角度出发，重组表达获得活力较高的 HPL，大大提高了其催化反应中 C6 醛的产量，但是反应过程中 HPL 的稳定性并没有得到提高。如果能将两种方法有效地结合起来，将会更进一步提高 C6 醛产量，从而推动此生物技术合成途径更快地实现工业化。.........
论文创新点
1、借鉴 HPL 在植物体内的存在形式，设计并制备了疏水间隔臂偶联的复合水凝胶微球以及疏水的磁性纳米微球用于 HPL 的固定化，得到了同时具有较高活力和稳定性的固定化 HPL。2、证明载体的表面疏水性以及固定化过程中磷酸盐溶液的浓度是获得高活力以及高稳定性固定化 HPL 的关键。3、使用扩散模型以及多层固定化模型研究了不同类型载体在 HPL 固定化中的差异并阐明机理。
...........
参考文献（略）
