拟胚体法诱导鼠胚胎干细胞形成大脑皮层神经元
中文摘要
目的 定向诱导胚胎干细胞形成大脑皮层神经元
方法 拟胚体法
结果
结论
关键词 ES细胞 拟胚体 神经分化 无血清悬浮培养 皮层神经元
Directed differentiation of telencephalic cautical neurons
from mouse embryonic stem cells by embryoid body
Abstract
Objective
Method
Result
Conclusions
Key words ES cells; Embryoid body; Neural differentiation; Serum-free suspention culture; cautical neurons
前言
在胚胎发生期间，端脑原基被细分为Pax6+背侧区域（皮层，可形成皮质，皮质皱褶和脉络丛）和Pax6-腹侧区域（皮下层，可形成基底核）。（Guillemot，2005；Puelles et al.，2000；Rallu et al.，2002）
最近，我们研发了一种高效的神经诱导方法，利用无血清悬浮培养技术诱导小鼠ES细胞（mESCs）向神经中枢选择分化。该法可使ES细胞自主发生神经分化，无需外部诱因。重要的是，此种诱导技术能使mESC高频分化为Bf1(FoxG1)+端脑前体细胞，其中大部分细胞表达皮质标记物Pax6，而Shh处理抑制Pax6表达，且诱导皮下层标记物表达，诸如Nkx2.1。
本文首先介绍一种改良的三维聚集培养法，此法可高效诱导ESC分化为皮质前体细胞和有功能的投射神经元。www.51lunwen.org/yxlwgs/ Then, using this ESC culture, we demonstrate the in vitro recapitulation of embryonic corticogenesis and its manipulation with respect to layer-specific neurogenesis and regional specification. 最后，我们验证了该法诱导的皮质前体细胞可自发形成分层结构，模拟了皮质发生的早期阶段。我们讨论了源自ESC的皮质神经上皮其自发形成组织的惊人能力。
1材料与方法
1.1 主要试剂及仪器
BALB/C孕母鼠一只，复旦大学医学院动物房提供
超净工作台 华山医院神经外科实验室
Nicon显微镜
一抗：
二抗：
流式分选抗体：
1.2小鼠ES细胞的培养
小鼠ES细胞在预先0.1%明胶(Sigma)包被的培养皿上培养， 置于 37℃, 5%的 CO 2 细胞培养箱。其培养基成分为G-MEM (Gibco)中添加 1% FBS (Gibco)、10%KSR (Gibco)、2 mM 谷氨酰胺 (Gibco)、0.1 mM 非必需氨基酸(Gibco)、1 mM 丙酮酸盐、0.1 mM2-巯基乙醇 (Gibco)和 2000 U/mL LIF (Gibco)[1]。ES细胞每隔 3d传代 1 次, 传代时用 0.05% 胰酶 (Gibco) 37℃消化 5 min. 细胞按照1:2~1:4的比例进行传代.
1.3 小鼠ES细胞的鉴定
免疫荧光
1.4小鼠ES 细胞向脑皮层神经元的定向分化
分化液成分为G-MEM (Gibco)中添加10%KSR (Gibco)、2 mM 谷氨酰胺、1 mM 丙酮酸盐、0.1 mM 非必需氨基酸(Gibco)、0.1 mM2-巯基乙醇 (2-ME)，250 ng/ml 重组人Dkk-1，和 1 mg/ml重组人Lefty-1(which can be replaced by 10 mM SB431542)。
SFEB法进行神经诱导时，用0.05%胰酶-EDTA 将ES细胞消化为单个细胞，以5×104个/ml细胞密度接种在10ml明胶包被培养皿上。细胞1天内凝结成团。接种ES细胞到分化液中的这天定义为第0天。
第3天 换液。
第5天 以1-2×102团/cm2细胞密度接种在另包被培养皿上(多聚赖氨酸，层粘连蛋白，纤维结合蛋白)。
第7天 更换另一种分化液。分化液成分为G-MEM (Gibco)中添加N2、2 mM 谷氨酰胺 (Gibco)、0.1 mM 非必需氨基酸(Gibco)、1 mM 丙酮酸盐、0.1 mM2-巯基乙醇 (2-ME)。
重组人BMP-4蛋白、人Dkk-1蛋白、人Lefty-A蛋白、小鼠Nodal蛋白、小鼠Shh-N 肽(25–198) 和小鼠Wnt-3A蛋白(R&D Systems)，以上这些因子每次换液时，另加入培养液中。
1.5脑皮层神经元的鉴定
免疫荧光，流式分选
2 结果
讨论
结论
参考文献
[1] Eiraku M., Watanabe K., Matsuo-Takasaki M., et al. Self-Organized Formation of Polarized Cortical Tissues from ESCs and Its Active Manipulation www.51lunwen.org/yxlwgs/ by Extrinsic Signals. Cell Stem Cell, 2008, 3(5): 519-532.
[2] Gaspard N., Bouschet T., Hourez R., et al. ,An intrinsic mechanism of corticogenesis from embryonic stem cells. Nature, 2008, 455(7211):351-U10
综述
参考文献
致谢
