探讨淋巴细胞的灭活能力及其对红细胞体外保存质量的影响

<p>随着造血干细胞移植技术等新的医疗手段在临床的广泛应用,输血相关移植物抗宿主病(TA-GVHD)被引起极大关注。因其临床表现缺乏特异性,极易漏诊和误诊并且病死率高达80%~90%,所以该病主要以预防为主[1]。国外从70年代发现γ、X射线辐照可以有效地破坏淋巴细胞活性,从而射线辐照血液被认为是一种预防TA-GVHD的唯一可靠方法。至于辐照血液的质量,目前国内外并无统一标准,一般遵循最大程度地灭活血液制品中的淋巴细胞(特别是T淋巴细胞),最低限度地减少有效血液成分的损伤为原则。笔者用不同剂量的γ射线辐照血液,并对淋巴细胞的灭活能力及其对红细胞体外保存质量的影响进行了探讨。<BR>1　材料和方法<BR>1.1　仪器　①血液辐照仪　Biobeam 8000德国STS公司。放射源为137Cs,活度117 TBq。中心剂量为2.93Gy/min,剂量率波动动幅度为+28%~-8.5%。试验参数设置以2.93Gy/min为标准,分别设置中心辐照剂量为10、25、35、45Gy。辐照杯为180°旋转,速度为20转/min,放射源上下运行距离为238mm,在0 mm和238 mm处分别滞留19%;②液体闪烁谱仪(1209-Rackbeta);③全自动血细胞分析仪(COULTER JTIR);④全自动生化分析仪(OLYMPUSAU400);⑤酸度计(BECKMANΦ50 pH Meter);⑥紫外分光光度计(岛津UV2000)。<BR>1.2　血标本制备　采血400ml/U(CPDA)全血为一例,每例标本均分装于5个塑料袋中,分别为未辐照(对照组)和10、25、35、45 Gy不同剂量的辐照组。<BR>1.3　淋巴细胞增殖检测　采用核素标记3H-TdR参入法[2]。标本为15例,采血当日每例标本按1•2方法制备成5组,辐照后即刻用淋巴细胞分离液分离淋巴细胞,最终浓度为1×106/ml。每份标本用Con-A(sigma)作有丝分裂原刺激(刺激组)和未刺激(对照组),分别于37℃培养56h后,参入3H-TdR (中国原子能科学院提供),16h终止。测定其cpm值,计算增殖指数。增殖指数=[(Con-A有丝分裂原)刺激组(cpm)-(未刺激)对照组(cpm)]/对照组(cpm) 每例标本以未辐照(对照组)的增殖指数为100%,计算其增殖率。　　增殖率=辐照组(不同剂量)的增殖指数/未辐照(对照组)增殖指数×100%<BR>1.4　红细胞质量检测　分为采血当天辐照组(0d辐照组)11例,采血后保存21d辐照组(21d辐照组)9例。每例分别按1.2方法制备5组标本,辐照后各自留取当日样本,其余血标本在4±2℃保存,于7、14、21、28、35d分别留取样本,作以下项目分析。<BR>1.4.1　血细胞分析仪检测红细胞计数、全血血红蛋白、红细胞分布宽度及pH值。<BR>1.4.2　红细胞ATP含量测定方法[3]　以高氯酸制备去蛋白ATP提取液,用酶法(试剂TOYOBO)分析红细胞中的ATP含量(μmol/L)。<BR>1.4.3　红细胞溶血率　联苯胺法测定血浆中的游离血红蛋白含量,计算每份样本的溶血率。　溶血率=血浆游离血红蛋白(mmol/L)/全血血红蛋白(g/L)×100%1.4.4　血浆K+、Na+测定　酶法(试剂RANDOX),用全自动生化分析仪检测。<BR>1.5　统计学分析　方差分析(Duncan新法),组内,辐照组与对照组两个重复测量因素的比较;组间,0d辐照组与21d辐照组两个重复测量的两两对比用q'检验。<BR>2　结果<BR>2.1　15例淋巴细胞增殖率　对照、10、25、35、45 Gy分别为100%、49.2%±5.49%、6.2%±2.95%、4.7%±2.71%、3.4%±2.36%,见图1。</P> <p><IMG src="//static.51lunwenwang.com/2011/1219/20111219173616334.jpg"><BR>2.2　全血pH　0d辐照组、21d辐照组保存期间各剂量辐照样本与对照组无显著性差别(q′<2•80 P>0.05),而21d辐照组pH显著低于0d辐照组同期保存的样本(q′>3•71P<0.01),见图2。</P> <p><IMG src="//static.51lunwenwang.com/2011/1219/201112191732581934.jpg"><BR>2.3　红细胞数量、红细胞分布宽度、无显著性差别(q′<2•80 P>0.05)。红细胞ATP含量保存期间各组间均无显著性差别(q′<2•80P>0.05),见图3。</P> <p><IMG src="//static.51lunwenwang.com/2011/1219/201112191734147969.jpg"><BR>2.4　溶血率　0d辐照组和21d辐照组比较,辐照当天各剂量辐照组与各自对照组无显著性差别(q′>2•86P>0.05),10、25 Gy剂量组保存到35d与对照组相比均无显著性差别(q′>2•86P>0.05),其余各剂量组溶血率均显著高于对照组(q′>2•86P<0.05,q′>3•82P<0.01),见表1。</P> <p><IMG style="WIDTH: 500px; HEIGHT: 189px" src="//static.51lunwenwang.com/2011/1219/201112191741795835.jpg"><BR>2.5　血浆K+　0d辐照组和21d辐照组比较,辐照当天各剂量辐照组与对照组无显著性差别(q′>2•86P>0.05)。各剂量辐照组保存期间血浆K+不同程度地高于对照组(q′>3•82P<0.01)。21d辐照组辐照当天血浆K+显著低于0d辐照组保存21d(q′>3•71P<0.01)。21d辐照组保存到35d K+>30mmol/L,显著高于同期保存的0d辐照组(P>0.01)见表2。</P> <p><IMG style="WIDTH: 500px; HEIGHT: 202px" src="//static.51lunwenwang.com/2011/1219/201112191744535746.jpg"><BR>2.6 血浆Na+　0d辐照组和21d辐照组比较,辐照当天各剂量辐照组与各对照组无显著性差别(q′<2•802•86P>0.05),保存期间辐照组血浆Na+不同程度地低于对照组(q′>3•71P<0.01)见表3。</P> <p><IMG style="WIDTH: 500px; HEIGHT: 197px" src="//static.51lunwenwang.com/2011/1219/201112191751297280.jpg"><BR>3 讨论<BR>TA-GVHD的发病原因之一与输入血液制品中异基因具有免疫活性的淋巴细胞的数量密切相关,但诱发TA-GVHD的最低数量并不清楚。有报道免疫缺陷的患儿输入104/kg淋巴细胞引发TA-GVHD致死[4]。辐照后血液中淋巴细胞的最低增殖活力有待确定。本文采用灵敏度较高的核素标记分析淋巴细胞扩增的方法检测淋巴细胞增殖能力。随辐照剂量的增加,淋巴细胞增殖率下降,但未达到0增殖。35Gy时增殖率<5%,依据剂量波动范围,当中心剂量35Gy时幅度为45 ~ 32 Gy,最高剂量低于英国标准(50 ~ 25Gy)[5]。<BR>各辐照剂量的辐照组,辐照当天和保存期间与对照组相比,红细胞数量、红细胞分布宽度均无显著性差别,保存到35d RDW在正常范围内(<14%),表明红细胞形态无显著性变化。红细胞ATP水平各组间均无显著性差别,与Suzk-i[6]报道相似。Moroff[7]报道ATP与红细胞输入体内24h恢复成正相关(r=0.63),表明辐照对红细胞代谢功能无影响。<BR>各辐照剂量的辐照组,辐照当天与对照组相比,溶血率无显著性差别,但随保存期延长除10、25Gy辐照外,其余各剂量组溶血率均显著性高于对照组,最高溶血率为0.44%低于最大溶血率1%(美国红细胞保存标准)。21d辐照组辐照后当天溶血率低于同期保存的0d辐照组,表明25 Gy以上的剂量引起保存期间严重溶血。Soszynski[8]认为辐照诱发溶血是因为电离作用使红细胞膜形成小孔所致。Moroff报道溶血率与红细胞体内恢复成负相关(r=-0.62)[7],对红细胞活性无不良影响。　　<BR>血浆K+、Na+在辐照当天,各剂量组与对照组均无显著性差别与文献[9]报道相似。随保存时间的延长各剂量组血