【摘要】目的 采用PCR技术对ABO血型系统进行基因型检验。方法 选择最佳扩增条件进行四引物复合扩增,用限制性内切酶KpnI和AluI分别酶解扩增产物,电泳分离、银染显色法检验ABO基因型。结果 对270例血斑、20例混合斑、20根毛发(有毛囊)、12份唾液斑等不同的生物检材进行了分型,与血清学方法检验结果相符。结论 该方法能够应用于法医学的检验。
ABO血型系统是第一个被发现的人类遗传标记系统,在输血、亲子鉴定、人类学研究、法医物证检验等领域中有着非常重要的应用价值。对于ABO血型,传统的检验方法是对抗原或抗体进行检验,在法医物证中最为常用的方法是检验抗原物质。由于ABO血型抗原是糖脂或糖蛋白,因此检验时易受抗原活性的强弱、抗体的特异性以及微生物的污染等因素的影响。对于性犯罪中的混合斑检验,传统血清学方法有很大的局限性,使这一难题长期得不到很好的解决。1990~1993年, Yamamoto[1~6]报道了ABO基因的苷酸序列,查清了各等位基因的差异,能够测定ABO基因。从目前所报道的文献来看,测定ABO基因型的方法主要有3类: (1)扩增产物限制性片段长度多态性(AmpRFLP)[7,8];(2)用等位基因特异寡核苷酸引物(ASOP)扩增[9]; (3)单链构象多态性(SSCP)[10]。本文选择最佳扩增条件进行四引物复合扩增,用限制性内切酶KpnI和AluI分别酶解扩增产物,电泳分离、银染显色法检验ABO基因型,简便可靠。对血斑、混合斑、毛发、唾液斑等不同的生物检材进行了分型研究,与血清学方法检验结果相符。该方法能够应用于法医学的检验。
材料和方法
(一)实验仪器及试剂1•实验仪器(1) DNA热循环仪(Bio-Rad公司)(2)电泳仪及小型电泳槽(Bio-Rad公司)2•主要试剂(1)引物P1: 5’-CACCGTGGAAGGATGTCCTC-3’P2: 5’-AATGTCCACAGTCACTCGCC-3’P3: 5’-GTGGAGATCCTGACTCCGCTG-3’P4: 5’-CACCGACCCCCCGAAGAAC-3’(2) Taq DNA聚合酶(PE-Cetus公司)(3) dNTP (华美生物制品工程公司)(4)内切酶KpnI (Biolabs公司)(5)内切酶AluI (Promega公司)(6) Chelex-100 (Bio-Rad公司)(7)聚丙烯酰胺凝胶电泳试剂(Bio-Rad公司)(二)样品采集及处理1•样品采集无关个体血样270份、混合斑20份(同时采集男女性血液)、唾液斑12份、毛发(有毛囊) 20根,均由自愿者提供。2•样品处理按文献[11~13]的方法,从血液、混合斑、微量血液(斑)、单根毛囊及唾液中提取DNA。(三) DNA的扩增PCR在25μl的反应体系中进行: 50mMKCl, 10mMTris-HCl pH8•3, 1•5mM MgCl2,0•01mg/ml白明胶, 200μM的每种无忧论文网dNTP,0•2μM的每种引物, 1~10ngDNA, 95℃热变性2min后加入0•5U Taq DNA聚合酶,置于DNA热循环仪中进行扩增。扩增程序为: 95℃变性30s, 60℃退火30s, 72℃延伸30s, 30个循环结束后再72℃外延伸3min。(四)扩增产物的酶解扩增产物的酶解在PCR反应体系中进行,直接加入2•5U KpnI和2•5U AluI,37℃酶解1h。(五)扩增产物的检测用8%T, 5%C, 0•75mm厚的小型垂直板聚丙烯酰胺凝胶电泳,银染显色的方法[11]检测扩增产物。凝胶用583型干胶机(Bio-Rad公司)干燥保存。
结果
ABO基因位点定位于人类染色体9q34上,该基因有A, B, O 3个等位基因, O基因缺失第261位核苷酸(G), A基因和B基因在第297, 526, 657, 703, 796, 803, 930位核苷酸有替换。由于其在cDNA序列上的差异,能够用PCR方法分析ABO血型系统的基因型。本文根据第261位核苷酸(G)缺失和第703位核苷酸替换(G→A)产生出两个酶切位点,设计出4个引物: P1位于cDNA第235位, P2位于基因内非编码插入序列, P3位于cDNA第663位,P4位于cDNA第803位。用引物P1, P2进行扩增,产生200bp (A或B)或199bp (O)的片段。199bp片段是由于cDNA第261位核苷酸(G)缺失造成的,从而产生KpnI的酶切位点(GGTAC↓C), O基因扩增产物经酶切后产生172和27bp的片段,而A或B基因产物不能被KpnI酶切。用引物P3, P4进行扩增,产生159bp的片段。由于A, B基因的cDNA第703位核苷酸的替换(G→A),从而产无忧论文网生出AluI的酶切位点(AG↓CT), B基因扩增产物经酶切后产生118和41bp的片段。A基因扩增产物159bp不能被AluI酶切。本文经过反复摸索,选择最佳扩增条件进行4引物复合扩增,产物在PCR反应体系中进行酶解,操作方便,结果稳定。如图1所示ABO基因的6种基因型。由于本方法是直接测定基因型,杂合子AO, BO很容易与纯合子AA, BB区分开来,增加了分型,提高了个人识别能力,增强了ABO血型在办案中的应用价值。经对270例血斑的ABO基因型进行分析,所得的ABO基因型与血清学方法检验结果相同。另外,对20例单根毛发的毛囊、12例唾液的分型研究,结果与表型相符。该方法能够应用于法医学的检验。某年内蒙古某市一女青年被强奸。经检验,受害人为A型,混合斑为A型精斑。当地公安局送来三名嫌疑人赵某(A型)、王某(O型)、李某(A型)的鲜血,要求我处检验。经我处检验,混合斑中精子的基因型为AO型,三嫌疑人的基因型分别为AA、OO、AO型,遂排除赵某、王某。后经DNA指纹图检验,认定精斑为李某所留。多年来,法医物证检验ABO血型的方法,包括检测抗体或抗原物质,局限性很大,特别是对于困扰法医物证多年的混合斑检验,效果不太理想。本文通过二步分离法从20例混合斑提取精子DNA,直接测定精子ABO基因型,结果与相应的男性血液ABO基因型相同,不受女性阴道分泌物污染的影响,在法医物证检验中能够发挥极其重要的作用。
参考文献
1•Yamamoto F, Clausen H, White T, et al. Molecular genetic ba-sis of the histo-blood ABO system. Nature, 1990, 345: 229~233
2•Yamamoto F, Hakomori S. Sugar-nucleotide donor specificity ofhisto-blood group Aand B transferases is based on amino acid sub-stitution. J Bio Chem, 1990, 265: 19257~19262
3•Yamamoto F, Marken J, Tsuji T, et al. Cloning and characteri-zation of DNA complementarity to human DUP-GaINAc: Fucal→2Gala→3Gal-Nac transferase (histo-blood group A trans-ferase) mRNA. J Bio Chem, 1990, 265 (2): 1146~1151
4•Yamamoto F, McNeill PD, Yamamoto M, et al. Molecular ge-netic analysis of the ABO blood group system: 1. Weak sub-groups: A3and B3alleles. Vox Sanguinis, 1993, 64: 116~119
5•Yamamoto F, McNeill PD, Yamamoto M, et al. Molecular ge-netic analysis of the ABO blood group system: 3. AXand B(A)al-leles. Vox Sanguinis, 1993, 64: 171~174
