摘要 目的:研究癫痫儿童拉莫三嗪(LTG)唾液与血清浓度的相关性。方法:在取得患儿及其家长知情同意的情况下,收集我院诊断为原发性或无需特殊病因治疗的症状性癫痫患儿,达稳态血药浓度后采集肘静脉血1 ml,并同时收集自然分泌状态下的唾液0.5 ml。使用反相高效液相色谱法(RP-HPLC)对血清及唾液浓度进行测定,数据分析采用统计学软件SPSS 11.5。结果:以LTG浓度(C)、LTG与内标的峰面积比(Y)作线性回归,分别得到血清浓度与有关神经学论文唾液浓度的回归方程:Y=0.1824C-0.0080, r=0.9998; Y=0.1816C-0.0119,r=0.9997。共收集39例癫痫患儿的53个血清及唾液浓度样本,其中男27人,女12人,平均年龄7.86岁(1~15岁)。LTG血清浓度(x)和唾液浓度(y)之间的相关性如下: y=0.5607x-0.6074(n=53,r=0.9510,P<0.001)。LTG唾液与血清浓度的比值为0.42±0.11。结论:LTG血清和唾液之间有显著的相关性,可以用唾液替代血液对LTG进行治疗药物监测,由于唾液的采集简便无创,尤其适用于儿童患者。
关键词 拉莫三嗪;唾液;治疗药物监测;反相高效液相色谱法
癫痫一直是危害儿童健康的一大顽症,药物治疗是目前最主要的治疗方法,拉莫三嗪(Lamotrigine, LTG,商品名利必通,Lamctal)作为一种新型的苯三嗪类广谱抗癫痫药,可以同时阻断兴奋性和抑制性神经递质,在临床中已经广泛用于部分性发作、全面性发作、以及婴儿痉挛症、Lennox-Gastaut综合征等难治性癫痫的添加治疗。其生物利用度约为98%,达峰时间为2.5 h,消除半衰期为24~35 h,蛋白结合率约为55%,有效治疗浓度为2.5~15μg•ml-1,无肝药酶诱导作用[1]。由于该药与常用的抗癫痫药如丙戊酸(valproic acid, VPA)、卡马西平(carba-mazepine,CBZ)等在药代动力学上有相互作用,以及患者之间的个体差异,导致个体间药物浓度差异较大,因此在临床应用LTG治疗癫痫,特别是多药联合治疗时,仅从给药剂量很难推测其血药浓度,有必要开展LTG药物浓度监测,实现个体化给药。
血液是治疗药物监测(therapeutic drug monitor-ing,TDM)工作中常用的药物浓度监测标本,但血液采集有创伤、易感染。而唾液采集无痛、经济、简便,尤其适用于儿童患者,而且唾液中蛋白含量极少,唾液浓度可以代表与药效直接相关的游离浓度,使之成为TDM的研究热点[2,3]。本文对癫痫儿童拉莫三嗪唾液与血清浓度的相关性进行了研究,并为此建立了用反相高效液相色谱法reversed-phase(high per-formance liquid chromatography, HPLC)测定拉莫三嗪血清及唾液浓度的方法,为拉莫三嗪唾液浓度监测的可行性提供了依据。
1 材料与方法
1.1 研究对象 2005年8月至2006年4月在北京大学第一医院小儿神经专科门诊就诊的癫痫患儿,均为原发性或无需特殊病因治疗的症状性癫痫;肝肾功能正常;服用LTG一个月以上,达到稳态血药浓度。血药浓度为临床常规监测的结果,不给患儿增加任何痛苦与负担,并全部获得了患儿及其家长的知情同意。
1.2 样本采集
1.2.1 血液样本采集 血药浓度达稳态后采集肘静脉血1 ml,静置后离心(室温, 4 000 r•min-1,10 min)分离出血清,置-20℃冰箱保存待测。
1.2.2 唾液样本采集 取血后立即留取。患者用清水嗽口后在自然分泌状态下,弃去最初的唾液,将贮于口腔内的唾液吐入试管,0.5 ml即可。若唾液量不足,可嘱其做口舌运动,以促进唾液分泌;若有足量的唾液但不能吐出(婴儿或有智力发育迟滞),则有专人用一次性吸管留取唾液。若唾液中存在残渣或沉淀物,可用4 000 r•min-1离心10 min,吸取上清液,置-20℃冻存。采集唾液后立即测定其pH,以避免CO2挥发使pH值升高,供解释结果时参考。
1.3 样本预处理 取0.1 ml患者血清(或唾液)至1.5 ml的离心管中,加15μg•ml-1的内标氟西泮(flurazepam, FZP)0.1 ml,以及0.1 ml磷酸盐缓冲液(pH=4.5),涡旋混匀30 s后加入1 ml二氯甲烷 异丙醇(95 5)混合液,涡旋混匀30 s,超声振荡10 min,离心4 000 r•min-110 min,吸取下层有机相,常温下用氮气吹干后加入0.1 ml甲醇复溶,取20μl进样分析。
1.4 药品、试剂和仪器 Waters高效液相色谱分析仪(美国Waters公司):Waters1525泵,Waters2487紫外检测器, Symmetry RP-18 (3.5μm, 3.9 mm×150 mm)色谱柱,Symmetry RP-18(3.5μm,3.9 mm×20 mm)色谱柱保护柱,Breeze 3.3色谱工作站;Rheo-dyne7725型六通进样阀(配以20μl定量环);TGL-16G型离心机(上海安亭科学仪器厂);WH-861型涡旋混合器(北京科尔德科贸有限公司);KQ50B型超声波清洗器(江苏山市超声仪器有限公司)。
试剂与标准品LTG标准品(德国SIGMA公司,10 mg/瓶,分析纯);FZP标准品(上海大众药业有限公司,分析纯),乙腈、甲醇、二氯甲烷均为色谱纯(加拿大CALEDON公司),异丙醇为分析纯(北京化学试剂公司),磷酸盐缓冲液(北京中杉金桥生物技术有限公司,分析纯),水为去离子水(北大医院中心实验室),人空白血清(北大医院血库)。
1.5 色谱条件 流动相为乙腈 磷酸盐缓冲液(30 70,pH=4.5),使用前超声脱气30 min;流速:1 ml•min-1;检测波长:305 nm;检测灵敏度:0.0001AUFS;柱温:37℃;进样量:20μl。
1.6 统计学分析 使用SPSS 11.5统计学软件,LTG血清、唾液的标准曲线采用线性回归,LTG血清与唾液之间的关系采用相关与回归分析,并对回归系数进行t检验。应用独立样本t检验比较服药3 h内与3 h后的浓度。各项测得结果用算术平均值±标准差(x±s)表示。设定当P<0.05时有统计学意义。
2 结果
2.1 方法学
2.1.1 色谱行为 在上述色谱条件下,血清与唾液中的LTG与内标FZP分离良好,空白血清与空白唾液均无内源性物质干扰,LTG与FZP的出峰时间分别为3.05 min和6.75 min。唾液与血清的色谱分离结果见图1。血清与唾液中LTG最低检测浓度均为0.05μg•ml-1。
2.1.2 标准曲线 取80μl的1 mg•ml-1LTG标准品原液,再加入1 920μl的人空白血清,旋涡混匀后用空白血清进行对比稀释,得到40、20、10、5、2.5、1.25、0.63、0.31μg•ml-1的血清标准液。取40μl的1 mg•ml-1LTG标准品原液,再加入1 960μl的人空白唾液,旋涡混匀后用空白唾液进行对比稀释,得到20、10、5、2.5、1.25、0.63、0.31μg•ml-1的血清标准液。取标准液各0.1 ml,分别加入15μg•ml-1的内标(FZP)0.1 ml,按照1.3项下操作,以LTG浓度(C)、LTG与内标的峰面积比(Y)作线性回归,分别得到血清与唾液的回归方程,结果见表1。
2.1.3 精密度与回收率 分别配置高、中、低3种浓度的LTG血清与唾液标准液(血清: 20、5、1.25μg•ml-1,唾液:10、2.5、0.63μg•ml-1),按照1.3项下操作计算精密度与回收率,结果见表2。
2.1.4 干扰实验 临床上常与LTG合用的抗癫痫药物卡马西平(CBZ)及其活性代谢产物10,11-环氧卡马西平(10,11-carbamazepine epoxide,CBZE)、丙戊酸(VPA无紫外吸收峰)、妥泰(topiramate,TPM无紫外吸收峰)、苯巴比妥(phenobarbital,PB)、苯妥英钠(phenytoin,PHT)在该实验条件下对LTG和FZP的测定均无干扰(图2)。出峰时间依次为LTG:3.05 min; CBZE: 4.22 min; PB: 5.08 min; FZP:6.75 min;CBZ:8.30 min;PTH:10.75 min。
2.2 相关性
2.2.1 患者资料 53个血药浓度来自39名癫痫患儿,其中男27人,女12人,平均年龄7.86岁(1~15岁),其中3例为LTG单药,其余均合并一种或多种ADEs,27例合并丙戊酸,10例合并卡马西平,5例合并奥卡西平,合并妥泰、氯硝西泮的各有6例。
2.2.2 血清与唾液浓度结果 39名患者的53个LTG血清浓度测定结果在0.46~15.45μg•ml-1之间,唾液浓度测定结果在0.21~9.35μg•ml-1之间,唾液浓度与血清浓度的比值为0.42±0.11(0.12~0.66)。唾液的pH值在5.4~7.0之间。LTG血清浓度(x)和唾液浓度(y)相关性分析的回归方程如下:y=0.5607x-0.6074(n=53, t=21.97, r=0.9510,R2=0.904,P<0.001),结果见图3。本实验中在服药后3 h之内采集的唾液浓度有9个,其唾液浓度与血清浓度的比值为0.42±0.09
