本文是一篇临床医学论文，本研究结果显示，不同的氧水平和葡萄糖浓度会影响羊颞下颌关节盘细胞的生长增殖，基质合成及呼吸代谢活动。许多研究表明，对无血管的组织细胞而言，葡萄糖是维持细胞存活的关键性营养素。研究牛髓核细胞发现其在有葡萄糖但是无氧条件下仍能存活，而在没有葡萄糖的情况下，无论有无氧气，细胞活力都显著降低[90]。对猪颞下颌关节盘细胞的能量代谢进行研究表明虽然葡萄糖和氧气都很重要，但是葡萄糖是细胞存活的限制性营养素。
第一章 绪论
1.1 颞下颌关节概述
颞下颌关节（Temporomandibular Joint，TMJ）是人体最大的双侧联动关节，在行使口腔颌面部的咀嚼、吞咽、发音等功能时起重要的作用[1]。颞下颌关节是人体内较为复杂的关节之一，由下颌骨髁状突、颞骨关节面和位于两者之间的纤维软骨关节盘组成[2]。TMJ 是颌面部的负重关节，为下颌提供相对于颅底的运动，分散运动时的应力，在下颌做功能运动时，缓冲外力，吸收震荡[3-5]。现从颞下颌关节盘的解剖与生理、颞下颌紊乱病的病因及治疗方法和颞下颌关节盘代谢特点等方面加以概述。
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1.2 颞下颌关节盘
颞下颌关节盘（Temporomandibular Joint disc，TMJ disc）是颞下颌关节行使功能的主要部分。颞下颌关节盘的形态为双凹椭圆形盘状，周围一圈较厚，盘中心区域薄。分为前、中、后带，后带中部最厚，中带最薄，中，外部次之[6]。由于颞骨关节面和髁突头的大小和形态不匹配，所以关节盘的主要功能是协调髁突关节面和颞骨关节窝的大小和形状，可以起到缓冲咀嚼压力以及分散咬合力的功能[7]。
TMJ 关节盘是由大量的Ⅰ型胶原、水和蛋白多糖及少量的细胞和弹性纤维组成的[8]。其中主要成分是纤维软骨，与椎间盘不同，椎间盘主要以透明软骨为主。 纤维软骨与透明软骨不同，透明软骨细胞分泌的细胞外基质成分主要是以Ⅱ型胶原为主，而纤维软骨细胞以Ⅰ型胶原为主[9]。文献中报道表明 TMJ 关节盘中存在大量胶原纤维，包括Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅵ、Ⅸ和Ⅻ型胶原，其中Ⅰ型胶原为主要成分, 其次还存在少量Ⅱ型和Ⅲ型胶原[10]。
关于 TMJ 关节盘的细胞组成，Detamore MS 对于猪颞下颌关节盘的研究发现，猪的 TMJ 关节盘中含有两种细胞，一种是类似纤维软骨的纤维软骨样细胞，一种是类似软骨的软骨样细胞，两种细胞比例为 7:3[11]；而 Berkovitz BK 对大鼠和狨猴的实验研究发现，年轻的大鼠和狨猴（1 岁左右鼠、1 岁以下狨猴）与年长的鼠和狨猴（2.5 岁鼠、10 岁以上狨猴）其 TMJ 关节盘细胞类型不同，年轻的的 TMJ 关节盘中缺乏软骨样细胞，而年长动物其关节盘中同时存在软骨样细胞和纤维样细胞这两种[12]；本实验课题组前期对羊 TMJ 关节盘的研究表明，幼龄羊（1 月龄）的关节盘由软骨样细胞和成纤维样细胞组成，其中以长梭形的成纤维样细胞为主，成纤维样细胞和软骨样细胞的比例大概为 2:1[13]。Loreto C 研究了人的 TMJ 关节盘的细胞组成，发现人类的关节盘主要由三种细胞组成：长梭形的成纤维样细胞、圆形的软骨样细胞和圆形的纤维软骨样细胞[14]。而 TMJ关节盘的细胞组成不仅在不同物种之间有很大差异，并且关节盘的不同带状区域之间的细胞种类也有很大差异[15]。
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第二章 常氧下不同葡萄糖浓度培养对羊颞下颌关节盘细胞能量代谢的影响
2.1 概述
葡萄糖是细胞能量代谢必须的营养素之一。营养供应的丧失被认为是导致TMJ 关节盘发生退行性改变的重要因素，但是营养供应丧失是如何影响关节盘细胞的并不清楚。椎间盘的研究表明，椎间盘是无血管组织，其细胞依靠椎间盘边缘的血液供应来获取营养，由于细胞的能量代谢主要通过糖酵解产生，椎间盘细胞需要足够的葡萄糖才能存活[79]。并且当椎间盘细胞培养环境中葡萄糖浓度低于 0.5mM 时，细胞开始死亡[80]。关节盘和椎间盘一样都是无血管组织，其营养供应方式不同于体内其余组织，营养供应的主要来源是周围滑膜液的弥散。且TMJ 关节盘组织的营养供应呈梯度变化[81]。目前研究指出能量代谢在细胞生理过程中的作用至关重要，对许多疾病的病理生理学研究有重要意义。我们采用的XFe Seahorse 能量代谢分析系统可以实时同步的检测糖酵解途径和氧化磷酸化途径这两种细胞内主要的能量代谢途径。从而为代谢疾病的研究带来新的手段[82]。有文献报道表明，培养环境中葡萄糖浓度的改变会影响细胞的耗氧率和产酸率[80]，提示葡萄糖的浓度对于细胞的能量代谢有重要意义。
因此本实验设计了 5 种不同浓度梯度的葡萄糖实验组（无糖（0mM）、微糖（0.5mM）、低糖（3mM）、正常糖（5.5mM）、高糖（22.5mM）。以此来探究不同葡萄糖浓度对于羊 TMJ 关节盘细胞能量代谢、增殖生长、合成分泌的影响。
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2.2 实验材料
2.2.1 实验动物
3-6 月龄健康羊（屠宰场直接购买新鲜羊头）
2.2.2 主要试剂及仪器
表 1 主要试剂
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第三章 低氧下不同葡萄糖浓度培养对羊颞下颌关节盘细胞能量代谢的影响....................29
3.1 概述...............................29
3.2 实验材料...........................29
第四章 全文总结.......................... 46
第三章 低氧下不同葡萄糖浓度培养对羊颞下颌关节盘细胞能量代谢的影响
3.1 概述
颞下颌关节盘是无血管的组织，关节盘中的营养物氧气和葡萄糖的浓度在组织中是呈梯度变化的[70]。第二章中我们通过调节培养基中的葡萄糖浓度模拟了TMJ 关节盘在体内葡萄糖环境的浓度梯度，然而关节盘内不太可能发生单独的缺氧或者缺糖，因为葡萄糖和氧气浓度的变化不能在体内独立发生[76]，所以本章研究模拟了颞下颌关节盘生理状态下缺氧缺糖的环境，设计了以不同葡萄糖浓度和不同氧气浓度共同作用于羊 TMJ 关节盘细胞的培养，同样设计 5 种不同浓度梯度的葡萄糖实验组：无糖（0mM）、微糖（0.5mM）、低糖（3mM）、正常糖（5.5mM）、高糖（22.5mM），同时增加氧气分压的变化，设计 2%氧气组作为低氧组与第二章的实验结果进行对比分析。观察葡萄糖和氧气的联合作用对于羊 TMJ 关节盘细胞其能量代谢、生长增殖及分泌合成的影响。
表 2 主要仪器
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3.2 实验材料
3.2.1 实验动物同第二章。
3.2.2 主要试剂及仪器同第二章。
3.3 实验方法
3.3.1 羊颞下颌关节盘细胞的提取
同第二章操作步骤。
3.3.2 羊颞下颌关节盘细胞的传代培养
同第二章操作步骤。
3.3.3 cck-8 细胞增殖检测
（1）细胞培养：将 p3 细胞以每孔 6000 个的密度接种至 96 孔板，按照不同葡萄糖浓度分为 5 组培养，每个实验组 5 个复孔，接种流程同第二章，接种完成后将培养板移入低氧孵箱中培养，2%O2，5%CO2，37℃。之后隔天换液，分组培养 1、2、3、6、9d 后取出检测。
（2）CCK-8 检测：同第二章操作步骤。
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第四章 全文总结
本研究结果显示，不同的氧水平和葡萄糖浓度会影响羊颞下颌关节盘细胞的生长增殖，基质合成及呼吸代谢活动。许多研究表明，对无血管的组织细胞而言，葡萄糖是维持细胞存活的关键性营养素。研究牛髓核细胞发现其在有葡萄糖但是无氧条件下仍能存活，而在没有葡萄糖的情况下，无论有无氧气，细胞活力都显著降低[90]。对猪颞下颌关节盘细胞的能量代谢进行研究表明虽然葡萄糖和氧气都很重要，但是葡萄糖是细胞存活的限制性营养素。而在低氧情况下，ATP 的产生，胶原及蛋白多糖的合成受到限制[76]。细胞增殖检测结果说明在培养环境中单纯的葡萄糖浓度变化在短期内（9d）内对细胞的增殖基本无影响。而低氧（2%O2）条件下，羊颞下颌关节盘细胞增殖受到一定程度的抑制，高糖组的增殖速率为常氧时的 60%，无糖组细胞增殖停滞并且出现细胞死亡的情况。细胞外基质检测结果说明随着糖浓度的增加大幅度的增加了细胞外基质的合成活动，低氧时其细胞外基质 COL-Ⅰ表达有所下调，COL-Ⅱ及蛋白多糖表达无变化。这提示了葡萄糖是保证细胞外基质合成的重要营养素。
线粒体功能评价说明常氧高糖条件下，线粒体数量及功能状态较好，无糖组出现了线粒体的肿胀变形。低氧下高糖组细胞的线粒体形态并无明显异常，线粒体数量出现代偿性的增加，而低氧无糖组细胞线粒体出现明显的肿胀变形。线粒在细胞生存和死亡中具有重要作用[99]。低氧会抑制线粒体的氧化磷酸化功能，导致线粒体产生更多的 ROS，而启动凋亡诱导因子等凋亡相关蛋白[100]。我们从 ROS和 SOD 含量结果分析可知低氧使羊 TMJ 关节盘细胞出现大量 ROS 的堆积，其中低氧高糖组由于具有更多线粒体数量而出现更加明显的 ROS 堆积现象。
参考文献（略）
