1 材料与方法
1. 1 材料
1. 1. 1 实验动物 健康新西兰白兔34只(南昌大学医学院动物实验部提供),月龄3~4个月,体质量2.0~2. 5 kg,雌雄兼有,术前用裂隙灯显微镜检查以排除眼前段炎性病变及角膜混浊,用Schi tz眼压计测量眼压以排除异常眼压。
1. 1. 2 主要试剂 二氨基联苯胺(diaminobenzidin,DAB)显色剂、小鼠抗大鼠PCNA单克隆抗体、小鼠抗人Ki-67、α-SMA单克隆抗体与山羊抗小鼠IgG购自北京中杉金桥生物技术有限公司。
1. 1. 3 实验仪器 鹰视蓝调酷眼
ALLEGRETTOEYE-Q 1010-2准分子激光治疗仪(德国WaveLightLaserTechnologicAG公司), LSK-One微型角膜上皮刀(法国Moria公司),透射电镜H-600(日本Hitachi公司)。
1. 2 实验分组与实验方法
1. 2. 1 实验分组 随机取32只兔右眼行去瓣型Epi-LASIK,设为A组;左眼行PRK,设为B组,同样参数(-6 D)行准分子激光切削。另外2只兔(4只未手术眼)为正常对照组,设为C组。将A、B组再随机平均分为术后4 h、1 d、3 d、5 d、7 d、14 d、1个月、3个月组,每组4眼。
1. 2. 2 手术方法 术前30 g•L-1戊巴比妥钠耳缘静脉注射全身麻醉(1 mL•kg-1体质量),术时滴用5 g•L-1盐酸丙美卡因滴眼液表面麻醉,每5 min滴眼1次,共3次。A组:钢丝开睑器开睑,LSK-One微型角膜上皮刀制作角膜上皮瓣,去除上皮瓣,范围7mm,行光学区6 mm、屈光度数-6 D的准分子激光切削。B组:钢丝开睑器开睑,体积分数20%酒精浸泡中央角膜上皮20 s,帮写硕士论文用角膜上皮铲由周边向中心机械刮除松动的角膜上皮,范围7 mm,行光学区6mm、屈光度数-6 D的准分子激光切削。术毕戴软性亲水角膜接触镜,睑缘1/3间断缝合2针,术后滴诺氟沙星眼液,每天4次。A、B组32只兔分别于术后4 h、1 d、3 d、5 d、7 d、14 d、1个月、3个月空气栓塞法处死并取角膜标本。每个时间点分别将3个角膜常规石蜡包埋切片行HE染色及Ki-67、α-SMA、PCNA免疫细胞化学染色; 1个角膜行透射电镜检查。同法处理C组4只空白对照眼。
1. 2. 3 HE染色 角膜标本用40 g•L-1中性甲醛溶液固定,常规脱水、渗透、石蜡包埋,连续切片,厚约4μm,常规HE染色,400倍光镜视野下计数角膜中央区前基质细胞数量,随机观察6个视野,取其均值。
1. 2. 4 免疫细胞化学 Ki-67、α-SMA、PCNA均采用PV-6002二步法免疫细胞化学检测试剂。脱蜡、水化组织切片。体积分数3%H2O2去离子水孵育10 min,PBS冲洗。滴加各自所需的一抗(小鼠抗人Ki-67单克隆抗体、小鼠抗人α-SMA单克隆抗体、小鼠抗大鼠PCNA单克隆抗体), 37℃孵育2 h,PBS冲洗,2 min×3次。滴加山羊抗小鼠IgG抗体-HRP多聚体, 37℃孵育30 min, PBS冲洗, 2 min×3次。选用DAB显色。蒸馏水冲洗、复染、脱水、透明、封片,400倍光镜视野下观察角膜中央区Ki-67、α-SMA阳性细胞及角膜切削缘区PCNA阳性细胞,随机取6个视野,分别记录阳性细胞数,计算平均值。
1. 2. 5 透射电镜检查 离体的角膜切割成1 mm×1 mm×1 mm小块,置入25 g•L-1戊二醛中前固定24 h,以0. 1 mol•L-1PBS(pH 7. 40)清洗并浸入10g•L-1锇酸中后固定2 h, PBS冲洗3次,丙酮梯度脱水。在丙酮与包埋剂(Epon. 812)混合液中浸透与包埋,半薄切片定位。制超薄切片,醋酸铀柠檬酸铅双重染色,在透射电镜下观察角膜上皮细胞形态变化并照相。
1. 3 统计学分析 采用SPSS 13. 0统计学软件包,用两样本均数t检验,单因素样本方差分析(One-WayANOVA)SNK、Dunnetts’s C-t检验进行统计学处理,P<0. 05为差异有统计学意义。
2 结果
2. 1 前基质细胞数量 正常角膜(C组)前基质细胞数量为每400倍光镜(88. 00±5. 38)个。术后各时间点A、B组平均前基质细胞数
