[摘 要] 目的:研究断肢再植后离断肢体骨骼肌缺血再灌注损伤的保护。方法:建立大鼠后肢的断肢再植模型,再植前应用灌注液对实验组离断肢体进行灌注,然后进行再植。缺血再灌注组不进行灌注直接通血,于通血后6 h取材,测定骨骼肌丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、线粒体ATP酶活性以及胫前肌含水量,观察骨骼肌损伤情况。结果:灌注液处理组胫前肌含水量为(77.86±0.75)%, ATP为(0.21±0.05)mmol•g-1•h-1, MDA为(5.62±0.35)μmol•g-1,SOD为(27.41±3.77) NU•mg-1,均较缺血再灌注组有明显改善。结论:断肢再植前应用灌注液对离断肢体进行灌注,可以减轻再植肢体中骨骼肌的缺血再灌注损伤。
断肢再植是临床中常见的急症之一。断肢再植后,骨骼肌恢复血供的同时,亦发生缺血再灌注损伤,其损伤程度将直接影响再植肢体的功能。根据国内外对骨骼肌缺血再灌注损伤(ischemia-reperfusion injury,IR)的研究情况[1-3],本研究应用灌注液在再植之前对离断肢体进行灌注,观察其对骨骼肌缺血再灌注的保护作用。
1 材料与方法
1.1 动物模型的建立 选用健康Wister大鼠18只,体重400~500 g,雌雄不限。随机分为正常对照组,缺血再灌注组,灌注液处理组,每组6只。后两组大鼠用3%戊巴比妥钠(30 mg•kg-1)腹腔麻醉。麻醉生效后,于左腹股沟处切开皮肤,在放大10倍手术显微镜下从左腹股沟韧带至膝关节游离出股动脉、股静脉,结扎除腹壁浅动脉以外的所有分支。游离出腹壁浅动脉及其伴行静脉,距起始处1.5 cm切断并结扎远端,灌注液处理组近端插入肝素化硅胶管,用3-0线固定并夹闭。完全切断除股动脉、股静脉、腹壁浅动、静脉以外的所有结构,缝扎止血。再用无创伤血管夹在腹壁浅动脉远、近端夹住股动、静脉,建立大鼠左后肢的断肢模型。将暴露的组织用37.3℃温林格氏液湿敷。
1.2 灌注液的配制 注射用能量合剂2 ml,地塞米松20 mg,维生素C 2.0 g,维拉帕米40 mg,加入5%的葡萄糖溶液200 ml中制成灌注液。
1.3 实验方法 缺血再灌注组大鼠左后肢缺血3 h后松开血管夹,恢复肢体血供。灌注液处理组大鼠左后肢缺血2.5 h后,松开股动脉远端血管夹,自腹壁浅动脉所插硅胶管用静脉输液泵以50 ml•h-1的速度灌注10 min,肢体内残存血及灌注液自腹壁浅静脉流出,灌注后再夹闭股动脉远端的血管夹。松开股静脉近端的血管夹,自腹壁浅静脉的硅胶管向近端灌注β-七叶皂甙钠5 mg。缺血3 h松开血管夹,恢复肢体血供。正常对照组动物游离出股动脉、股静脉后,不再予以处理。恢复肢体血供6 h后,予以过量3%戊巴比妥钠处死3组大鼠,然后进行取材。切取实验侧肢体胫前肌,称量湿重,烤箱内烘干后再称量,计算肌肉含水量。切取实验侧腓肠肌100 mg,所有标本均及时用冰生理盐水冲洗,然后按1∶9的重量体积比加入生理盐水中,于低温(0~4℃)下电动匀浆1 000 r•min-1离心10 min,制成10%的匀浆液,再1 000 r•min-1离心30 min,取上清液进行生化测定。
1.4 测定方法 ①MDA的测定:MDA与硫代巴比妥酸在酸性环境下,于沸水中可形成粉红色复合物(532 nm波长处有最大吸收峰),通过测定MDA的生成情况,间接估计脂质过氧化的程度,从而了解活性氧对细胞膜的损伤程度。试剂盒购于南京建成生物工程研究所。②SOD的测定:采用黄嘌呤及黄嘌呤氧化酶反应系统产生超氧阴离子自由基(O•2),后者氧化羟胺形成亚硝酸盐,在显色剂的作用下呈现紫红色,在550 nm处有最大吸收峰。试剂盒购于南京建成生物工程研究所。③ATP酶的测定:ATP酶可分解ATP生成ADP及无机磷,测定无机磷的量可判断ATP酶活力的高低。试剂盒购于南京建成生物工程研究所。
1.5 统计学处理 所有数据用SPSS统计学软件进行处理,数据以x±s表示,采用t检验。
2 结 果
灌注液处理组胫前肌含水量、ATP、MDA、SOD均较缺血再灌注组有明显改善,
3 讨 论
骨骼肌缺血再灌注损伤是一个多因素参与,多机制损伤的过程。能量代谢障碍、钙离子超载、氧自由基、白细胞介导的炎症反应等因素在骨骼肌缺血再灌注损伤中起关键作用[4]。肌肉组织是对缺血最为敏感的组织之一。肢体大血管损伤、止血带使用不当、动脉血栓形成、骨筋膜室综合征、外伤性断肢再植、肌肉移植等均可造成肌肉组织不同程度的缺血。骨骼肌缺血损伤轻者早期局部变性坏死,晚期纤维化、挛缩、影响功能,重者可致整个肢体坏死、截肢,甚至危及生命。因此,设法减轻肌肉缺血损伤程度有极大的临床意义。肢体经历一定时期的缺血,在血供完全恢复后可出现比缺血时更为严重的损伤。即再灌注损伤。目前认为主要是再灌注时产生了氧自由基,氧自由基对细胞的任何成分均能造成损伤。氧自由基能攻击生物膜中的多不饱和脂肪酸,引发脂质过氧化作用,引起细胞损伤。MDA是自由基引起的脂质过氧化终末代谢产物,SOD可以将超氧阴离子这一脂质过氧化的主要自由基歧化为过氧化氢和水,SOD活力的高低间接反映了机体清除自由基的能力,测定MDA、SOD含量,可间接反映氧自由基的生成及其所致组织细胞损伤的程度。能量不足直至耗竭是启动氧自由基产生的关键因素。细胞缺血再灌注时,线粒体ATP酶在氧自由基等损伤因素作用下受到损害,线粒体内外离子浓度失衡,加重能量代谢障碍。β-七叶皂甙钠具有明显的脱水作用,可以防止细胞及细胞器肿胀破裂。同时,β-七叶皂甙钠是一种自由基清除剂,特别是对毒性强的羟自由基,可降低其毒性并经歧化作用而解毒[5]。维拉帕米能够通过质膜电压依赖性钙离子通道阻滞阻止细胞外钙离子内流,减轻细胞的高钙负荷。Stankovicova等[6]的实验证实维拉帕米可阻止细胞外钙离子内流,缓解钙超载引起的Na+泵抑制,促进细胞内外离子平衡的恢复,有效缓解骨骼肌缺血再灌注损伤,延缓缺血损伤引起的肌质网扩张、线粒体肿胀、核染色质凝聚现象出现的时间及Na+-K+-ATP酶和Ca2+-ATP酶活性下降的时间。地塞米松既可以阻断脂性炎症介质的形成过程,又可以影响白细胞膜上结合钙的释放,抑制溶酶体的释放及超氧化物的产生,几乎可阻断炎症所有的环节,能够有效抑制炎症的发生发展。本研究结果表明,对离断的肢体在再植前进行灌注,由于灌注液中含有ATP、维拉帕米、地塞米松等物质,可以从不同途径减轻骨骼肌的缺血再灌注损伤。同时,在恢复再植肢体的血液循环之前,从静脉给予β-七叶皂甙钠,可以减轻细胞水肿,并阻断羟自由基的毒性作用。灌注液中含有的各种药物及β-七叶皂甙钠在共同应用于临床的过程中,彼此之间是否会产生协同作用或拮抗作用,药物的应用剂量,灌注液的配制,灌注时间及灌注速度还有待于进一步研究。
[参考文献]
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[3]杨发民,曾炳芳,张长青.高能灌注液对骨骼肌缺血保护作用的研究[J] .中华手外科杂志, 2001, 17: 246-249.
[4] Rubin BB, Romaschin A, Walker PM, et al. Mechanisms ofpostischemic injury in sketetal muscle: intervention strategies[J]. J Appl Physiol, 1996, 80: 369-387.
[5]蓝 旭,刘雪梅,葛宝丰,等.β-七叶皂甙钠抗肢体缺血再灌注损伤的作用[J].中国微循环, 2001, 5 (3): 189-191.
[6] Stankovicova T, Zemkova H, Breier A, et al. The effects ofcalcium and calcium channel blockers on sodium pump [J].Pflugers Arch , 1995, 429: 716-721.
