[摘 要] 目的:选择培养表皮角朊细胞时添加表皮细胞生长因子(EGF)及小牛血清的最适浓度。方法:添加不同浓度的EGF及小牛血清,测定3H-TdR掺入量。结果:添加20μg•L-1EGF时3H-TdR掺入量明显高于添加5和10μg•L-1EGF时。结论:20μg•L-1EGF、20%小牛血清为培养表皮角朊细胞的最适浓度。
国内外不少烧伤中心都采用体外培养的表皮细胞膜片治疗烧伤病人,开辟了治疗皮肤缺损新的皮源途径[1]。本文作者曾用皮肤的酶消化培养法,成功地分离、培养和鉴定了角朊细胞[2],本实验观察了表皮细胞生长因子(EGF)、小牛血清对角朊细胞的影响。
1 材料与方法
1.1 试 剂 DMEM培养基(GIBCO公司),HamF12培养基(GIBCO公司),胰岛素(Sigma公司),转铁蛋白(Sigma公司),霍乱毒素(Sigma公司),两性霉素B(Sigma公司),胰蛋白酶(上海化学试剂采购供应站进口分装),Dispase(Becton Dick-inson Labware),小牛血清(大连生物试剂厂)。其余试剂均为市售分析纯。
1.2 角朊细胞的分离和培养 见参文[2]。
1.3 EGF和小牛血清对培养角朊细胞DNA合成的影响 消化分离得到的角朊细胞悬液以1×104孔的细胞密度接种于96孔板,细胞接近铺满单层时吸掉培养液,更换培养液培养24 h后添加EGF和小牛血清,EGF浓度分别为30、20、10、5和2.5μg•L-1,小牛血清浓度分别为30%、20%、15%、10%、5%,培养结束前3 h每孔加入3H-TdR37 kBq,培养结束后,吸掉培养液,D-Hank′s液洗3次,0.25%胰蛋白酶消化,吹打分散细胞,再加入等量的10%三氯醋酸,4℃条件下过夜,用玻璃纤维滤膜收集细胞,5%三氯醋酸冲洗,无水酒精干燥后烤干,测定放射性计数。
2 结 果
2.1 EGF对角朊细胞增殖的影响
2.2 小牛血清对角朊细胞增殖的影响
3 讨 论
自从1949年Lewi建立用皮肤组织块培养角朊细胞以来,角朊细胞培养技术不断改进,特别近20年来取得了迅速发展,已建立了滋养层培养法[3]、无血清培养法[4]及模拟机体生理状态的液气界面培养法[5]。这些方法所需实验条件不同,适于多种应用。无血清培养法所用培养基价格昂贵,目前大多实验室应用滋养层培养法,用EGF和小牛血清促进表皮角朊细胞的增殖。EGF有明显促进角朊细胞增殖作用,在3H-TdR掺入法测定中随着EGF含量的增加对角朊细胞DNA合成有明显的促进作用。当EGF在2.5 mg•L-1浓度时这种促进作用不明显,但是其后随EGF浓度的增加可以看到有明显促进细胞DNA合成作用,浓度增加到20 mg•L-1以上时,已达到平衡状态,提示其最适浓度为20 mg•L-1。血清是组织培养中最常用使用的培养基成分,含有许多种维持细胞生长增殖不可缺少的成分,但也含有许多难以控制的复杂的不明成分。因此培养基中含量过多或过少都不利于细胞的培养。本文作者曾观察不同浓度小牛血清对角朊细胞DNA合成的影响,以选择一个培养角朊细胞的最适浓度,培养基中添加小牛血清浓度5%以上时有较强的刺激角朊细胞增殖作用,其中添加20%小牛血清又比添加10%小牛血清促进角朊细胞增殖能力明显增强(P<0.01),培养基中添加20%小牛血清为宜。
[参考文献]
[1]黑柳能光,盐谷信幸.生物学的创伤被覆材[J] .BiomedicalPerspese,1995, 4: 1-4.
[2]马 刚,杨同书,颜炜群,等.复合培养人工皮肤的制备[J] .中华皮肤科杂志, 1990, 31 (2): 121-122.
[3]郑志忠.人表皮角朊细胞的分离、培养和鉴定[J] .中华皮肤科杂志, 1990, 23 (3): 156-158.
[4]王 刚,刘玉峰.人表皮角朊细胞的无血清培养[J] .中华皮肤科杂志, 1993, 26 (4): 237-238.
[5]丸口友子,松田和也.人工皮肤をマトリックスとしも复合培养皮肤作成[J] .日本形成外科学会会志, 1992, 12: 351-358.
