探讨二妙散组方的科学性
关键词：医学；中国传统；皮肤；移植；异体；免疫；细胞；小鼠
二妙散(丹溪心法)由黄柏和苍术组成具有清热燥湿作用，主治湿热注于筋骨所致的筋骨疼痛及足膝红肿疼痛;湿热不攘，筋脉弛缓所致的痛痰症，以及湿热积于皮肤引起的皮疹等，并有肯定的疗效‘’二。这些症候可能与某些变态反应疾病有一定关系。本文主要观察二妙散和其拆方的单味药对植皮小鼠细胞免疫是否有抑制作用，为探讨二妙散组方的科学性和寻找中医方药的免疫抑制剂提供实验依据。
材料和方法
一、动物和试剂
BALB/c(体Zd)和C。:BL/6(H--Zb)小鼠，雌性，8周龄左右，(购自中国医学科学院药物所动物室)。
兔抗C3H小鼠脑血清:卫生部上海生物制品研究所产品，具有抗小鼠Thyl抗原特异性，其细胞毒效价为i:160(杀伤50%Thy一+细胞)，工作稀释度为1:40。
兔抗小鼠胸腺细胞血清:本室自制，用刚断奶BALB/C小鼠胸腺细胞免疫家兔制备，并经小鼠红细胞和肝细胞分别吸收‘”，其抗胸腺细胞毒效价为1:400。
补体:采自豚鼠血清，经小鼠胸腺细胞吸收后，用RPMI一164。(日本日水制药株式会社产品)培养液作1:5稀释备用。
中药:黄柏和苍术购自北京市同仁堂中药厂。黄柏，苍术和二妙散分别制成100%煎剂(1克生药/lml)。
二、实验分组
将BALB/C小鼠随机分为生理盐水(NS)对照组，二妙散(EMS)组，黄柏(CP)组，苍术(RA)组和ATS组共5组，每组5~13只小鼠。
于植皮开始前3天Ns对照组给生理盐水，各中药组分别给100%中药煎剂，每只每天1ml灌胃，连续21天，ATS组于植皮前3天及植皮时，每只动物腹腔内注入O.sm1ATS，以后每隔7天重复1次。于植皮后7天取尾静脉血测定T细胞值，植皮后18天取脾测定脾细胞指数。
三、观察指标
(一)T细胞绝对值:取小鼠尾静脉血，按常规作白细胞总数和分类计数;参照文献‘”作酸性非特异性醋酶细胞百分率测定，T细胞值=白细胞总数x淋巴细胞百分率x酸性非特异性醋酶阳性细胞百分率(个细胞/mm，)。
(二)脾细胞毒指数(splenoeyteeytotoxie index，Cl)参考文献‘”‘’作补体依赖细胞毒试验(染料排除法)，小鼠摘眼球放血致死，取脾，在pH7.4的RPMI一1640溶液中制成脾细胞悬液，通过120目尼龙网筛，使成单个脾细胞悬液，用0.17mol/LTris一NH‘ClpH7.4缓冲液处理以除去红细胞。以染料排除法测活细胞率，要求脾细胞存活率在95%以上。最后用5%小牛血清一RPM卜1640培养液调节细胞浓度至1X107细胞/ml，置冰浴中备用。取_匕述脾细胞悬液，1，10兔抗鼠脑血清和1:5豚鼠血清各o.lml混匀，置37℃水浴中30min，分别取各试管的细胞悬液加等体积的苯胺黑，在光镜下计数200个细胞，并计算其中着黑色的死细胞百分率，试验同时以56℃，30min灭活补体作对照，按下列公式计算Cl。Cl代表小鼠脾细胞中Thyl十T细胞的百分率。
Cl(%)=实验管死细胞率一对照管死细胞率100一对照管死细胞率x100%
(三)同种异体皮肤移植试验:参照文献‘5’
在清醒状态下固定BALB/C小鼠(受鼠)，将雌性C57BL/6小鼠尾皮片(0.6x0.sem，)粘贴到受鼠腹背部作皮片移植，观察皮片生长情况，以50%皮片坏死时间(天)(median survival time，MST)一半数生存期为排异反应开始，移植物存活时间以其又士SD表示。
结果
一、二妙散延长植皮小鼠皮片存活时间。
从表1可见EMS以及单味药CP，RA和ATS均有延长植皮小鼠皮片的MsT的作用，与NS对照组相比差异非常显著。
二、二妙散降低植皮小鼠的T细胞值和Cl(表2)。
由表2可知ATS，二妙散和黄柏均可明显地降低植皮小鼠外周血中的T细胞值，与NS对照组比P<0.01或p<。.001，而苍术仅能轻度降低T细胞值。从植皮小鼠的Cl看，4个药物组均有降低Cl的作用，与NS对照组比差异显著，其作用强度顺序为ATS>二妙散>黄柏>苍术。
讨论
鉴于T细胞既参予细胞免疫，也具有调节抗体生成的作用，故本研究首先选择了植皮小鼠为动物模型，来观察二妙散及其单味药的作用;并以已知具有很强抑制移植排斥反应的ATS作为阳性对照药。据报道ATS还可以显著降低外周血之T细胞值，以及使脾脏中胸腺依赖区的淋巴细胞排空‘“’。我们的实验结果证明，ATS和二妙散均可以延长同种异体皮肤移植皮片的存活时间，降低植皮小鼠外周血中T细胞值，同时还可显著减少植皮小鼠脾细胞中Thyl十T细胞数(Cl)。这些改变都一致地说明了二妙散可能是通过抑制细胞免疫功能，使同种异体移值的排异反应得到一定程度的抑制。
众所周知，移植抗原均为TD抗原。这些抗原使TH细胞活化后才能使Tc前体细胞分化成熟为更多的TC细胞，T“乃在皮肤移植反应中发挥杀伤移植物的作用。因此，二妙散使植皮小鼠血内T细胞总数减少，也包括了TH细胞和Tc细胞同时减少;而脾中Thyl+T细胞减少可能是二妙散使移植抗原作用下T细胞分化和增殖减弱，进入脾内和外周血的T细胞相应减少，最终导致皮肤移植排斥现象推迟发生。
我们还进一步证明黄柏和苍术单独使用，仍表现出类似二妙散对皮片存活时间的延长作用，并降低植皮小鼠脾内T细胞数的作用，黄柏的抑制细胞免疫作用接近于二妙散，而苍术作用较弱，这说明二药相配伍组成二妙散在抑制植皮小鼠细胞免疫作用中具有协同作用。
参考文献
1.段富津.清热祛湿—二妙散。见:许济群，主编。方剂学。第一版.上海:上海科学技术出版社，1953:284.
2.Li Shaokang, etc.. http://www.51lunwen.org/ Murine lymphocyte surface antigen heterologous antiserum preparation, identification and application. Shanghai journal 1983; 3 ( 2): 114
3.姜世勃，等.T淋巴细胞酚酶活性检测法的改进及其影响因素.上海免疫学杂志1983，3(4):254。
