本文是一篇工程硕士论文，本研究针对微藻生物柴油生产成本高、废物资源化利用率较低等存在的问题，开展优势微藻利用VFAs生长、脱氮除磷以及产油的研究。
第1章绪论
1.1课题背景
化石燃料占全球能源需求的绝大部分，这些燃料的燃烧与全球变暖和大气污染直接相关，而且据估计，可开采的煤炭和石油将在几个世纪甚至几十年内耗尽，这迫切要求各国加快寻找清洁、高效的可再生能源[1,2]。“十四五”期间，国家指出要实施可再生能源替代行动，加快推进可再生能源的发展。近年来，生物柴油作为一种环保燃料被认为是最具潜力的可再生能源之一[3,4,5]。作为第三代生物柴油的生产原料，微藻因其不占用耕地、生长速度快、细胞内脂质储存丰富等优点受到广泛关注[6,7]。然而目前培养成本高和脂质产率低是微藻油脂生产面临的主要挑战[8]。因此，选择具有高生物燃料生产潜力的藻株以及寻找廉价的碳源来培养微藻成为解决问题的关键。
厌氧发酵处理有机废物的过程中能够将微生物难以直接利用的复杂底物转化为VFAs，这类物质的积累不仅抑制产能过程还会对生态环境造成潜在的危害，除此之外发酵废水中还含有氮、磷等营养物质，适于作为微生物生长的廉价原料[9]。众多研究表明VFAs可以作为微生物生长的良好碳源[10]。因此若能选择可以高效利用VFAs生长和产脂的优势藻株，既可以降低微藻生产油脂的成本，又能强化去除氮、磷等物质，实现底物的梯级利用，这将实现低成本生产可再生能源和环境保护的双赢局面。
本研究从突破微藻制油的高成本和低产率的限制出发，筛选能适应VFAs环境且脱氮除磷性能较好的优势能源微藻并优化其培养条件，探索微藻生长与底物利用效率和脂质积累之间的关系，考察微藻利用产酸废水生长产能的潜力，探讨微藻高效脱氮的作用机理，为耦合废物利用和微藻培养提供理论及技术支持。
1.2微藻藻种的筛选
不同藻种处理废水的能力存在差异，因此选择环境适应能力强、能够高效脱氮除磷的藻株十分关键。Li等人研究发现，将从氮磷浓度较低的环境中分离纯化获得的栅藻（Scenedesmus sp.LX1）用于处理二级出水，总氮和总磷的去除率均在98%以上[11]。还有研究用市政废水培养从本地土壤环境中分离获得的微藻Scenedesmus rubescens SX，最终获得了57.91%的COD去除率，96.38%的氨氮去除率以及93.68%的总磷去除率[12]。众多研究表明从自然水体或者污水处理厂筛选获得的藻种往往具有更强的环境适应能力及污染物去除效果[13]。
此外，微藻在处理废水的同时还可以有效积累生物质。在微藻油脂生产过程中，微藻产生脂质产量和脂肪酸特性的能力取决于不同的物种和培养条件[14]。小球藻（Chlorella）和栅藻（Scenedesmus）以及微拟球藻（Nannochloropsis）三个属已被广泛研究并证明它们具有扩大应用的潜力[15]。除了三个热门研究的藻属外，各藻属的脂质含量范围存在明显差异。大多数微藻属的脂质含量大致在10%到50%之间，其中杜氏藻（Dunaliella）[16]、脂球藻（Graesiella）[17]和麦可属（Mychonastes）[18]的总体脂质含量较高（脂质含量约为50%），而衣藻（Chlamydomonas）[19]、角毛藻（Chaetoceros）[20]和拟小球藻（Parachlorella）[21]很少被研究且研究报道的脂质含量相对较低（脂质含量约为15%）。高脂质含量并不是候选微藻筛选的唯一标准。有研究认为产脂能力是选择产油藻类的最重要标准[22]。研究表明麦可藻（Mychonastes afer）和单针藻（Monoraphidium sp.QLY-1）具有良好的油脂生产性能，油脂含量分别达到49.30%和37.68%，在光自养条件下最高油脂产量分别达到127.36 mg/L/d和140.67 mg/L/d[18,23]。产油微藻的选择也基于合适的脂肪酸特征，这是生物柴油燃料特性的决定因素[24,25]。脂肪酸饱和度受培养条件影响，例如有研究表明在缺氮培养基中生长的斜生四链藻（Tetradesmus obliquus）和链带藻（Desmodesmus abundance）的脂肪酸甲酯（FAME）含量最高，脂质特征突出了饱和FAME的丰度（C16:0和C18:0），这有利于生物柴油更好的粘度和适用性[26]。
因此，筛选优势藻种是提高废水处理效率及生物质产量的基础与关键。
第2章高效利用挥发性脂肪酸的优势能源微藻的分离及环境条件优化
2.1前言
微藻为光合自养生物，以空气中的二氧化碳为唯一碳源进行生长。但在自养条件下，光限制等因素导致微藻生长量很小，这限制了其大规模生产[103]。而某些微藻能够在混养或异养条件下利用外加有机碳源更好地生长[104]。VFAs是厌氧消化过程中的重要中间产物[85]，对生态环境存在潜在的危害性，已有研究将其用作碳源培养产油微藻。因此，为解决微藻培养的高成本和低产率等问题，选择能较好地利用VFAs生长的藻株是实现微藻生物能源的规模化生产的重要基础。本研究分离纯化出了一株耐受VFAs且脱氮除磷能力良好的藻株。此外，微藻培养的环境条件是影响其生长和底物利用的关键因素。有研究表明，VFAs比例对微藻的生长和产脂有显著的影响[105]。为提高氮磷的利用效率，寻求微藻利用VFAs的最佳培养模式，本研究评价了混养、异养条件下不同VFAs比例对该藻株的生长、底物利用和产脂的影响，以期获得一条同时实现废物利用和生物能源生产的有效途径。
2.2实验材料
2.2.1实验藻种来源及预培养
本研究选用的藻种为链带藻（Desmodesmus sp.XNY-2104），分离于齐鲁工业大学校园污水中水站曝气生物滤池。微藻在接种前置于光照培养箱中（BG11培养基，25±1℃，40μmol/m2/s，光暗周期比为24 h:0 h）富集培养。
2.2.2培养基
藻种富集培养所用培养基为BG11，培养基成分见表2.1。配置完毕后调节pH至7.0左右，高压灭菌后（120℃，30 min）可投入使用。
第3章 优势能源微藻利用产酸废水的研究 ...................... 29
3.1 前言 .......................... 29
3.2 实验材料 ............................... 29
第4章 优势能源微藻利用挥发性脂肪酸高效脱氮的作用机制研究.............38
4.1 前言 ................................... 38
4.2 实验材料 ...................................... 38
第5章 结论与展望 ....................... 50
5.1 结论 ............................... 50
5.2 展望 ........................ 51
第4章优势能源微藻利用挥发性脂肪酸高效脱氮的作用机制研究
4.3实验方法
4.3.1实验设计
本实验以6 g/L VFAs（AA:PA:BA=8:1:1）作外加有机碳源，向BG11培养基（无N）中分别添加NaN O3、NaN O2、NH4Cl作氮源，共设置100%NO3--N、100%NO2--N、100%NH4+-N、NO3--N:NH4+-N=1:1、1:2、2:1六组氮源种类，初始氮浓度设置为247 mg/L，每个组别设置3个平行，灭菌后备用。
将培养至对数期的索罗金小球藻和链带藻分别离心浓缩后接种至上述培养基中，使得初始接种密度为0.15 g/L左右，接种完成后用纱布和无菌膜封口，放置于恒温光照培养箱中于黑暗条件下培养。每日摇晃锥形瓶两次以防沉淀。每隔24 h取样测定微藻的吸光度、水样的pH和Fv/Fm，然后将水样经0.45μm滤膜过滤并收集滤液用于测定TN、NO3--N、NO2--N、NH4+-N、TP的浓度，在培养的第0、4、7天离心收获藻细胞制成藻粉用于测定油脂含量。
第5章结论与展望
5.1结论
本研究针对微藻生物柴油生产成本高、废物资源化利用率较低等存在的问题，开展优势微藻利用VFAs生长、脱氮除磷以及产油的研究。筛选获得了一株可耐受VFAs且脱氮除磷能力良好的优势藻株，考察了环境因素对微藻脱氮除磷及耦合产能的影响及微藻生长与底物利用和能源物质积累之间的关系。探究了分离获得的藻株与前期研究证明可耐受VFAs的异养型微藻利用产酸废水的潜力。考察了不同氮源类型对微藻生长、脱氮除磷及产能的影响并探讨了优势藻株高效脱氮的作用机理，主要研究结论如下：
（1）采用平板涂布分离法、平板划线法从校园污水中水站曝气生物滤池中获得了一株可耐受VFAs且脱氮除磷能力良好的优势藻株，经形态学和分子生物学鉴定确定为链带藻属，将其命名为Desmodesmus sp.XNY-2104。考察了在混养、异养条件下不同VFAs比例（8:1:1，7:1:2，7:2:1，7:3:0，6:1:3，6:3:1，5:4:1）对链带藻生长、氮磷去除及油脂积累的影响。综合考虑微藻的生长代谢情况，确定异养条件下VFAs比例为8:1:1为链带藻的最佳培养条件，该条件下获得的生物量为0.27 g/L，获得了更高的TN去除率（99.86%）、TP去除率（99.28%），VFAs利用率（AA、PA、BA分别为56.37%、33.65%、54.35%）以及油脂含量（38.63%）。
（2）考察了分离纯化获得的链带藻和前期研究证明可较好地利用VFAs的异养型微藻索罗金小球藻在混养、异养条件下利用产酸废水生长及脱氮除磷的能力。两株藻在接入产酸废水后均能迅速积累生物量并有
