第一章文献综述
高粱，禾本科植物，世界性的重要农作之一，产量仅次十玉米，小麦，水稻和大麦，位居世界第五大粮食地位。高粱，碳四植物，具有较强的抗旱性，产量高，适应性强，抗盐碱及耐涝性等的特性和较强的杂种优势，被广泛种植十干旱和半干旱的地方，发挥着巨大的增产潜能。在中国，高粱也是重要的饲料和能源作物。随着近年来我国在农业产业机构的调整和改革中，以及畜牧业和新兴生物能源方面的发展，高粱在逐年增加种植面积，越来越在国民经济中发挥其巨大的作用。
面制食品，五谷杂粮一直是我国人民的主要传统主食之一，在我们的膳食结构当中占重要比例。随着人民生活水平的不断进化，饮食和健康越来越受到人们的重视。民众不但要吃的好，吃的饱，更要吃的营养齐全。但面制食品在制作，储存，加工过程中容易褐变，影响中国人对面粉白度，色泽的嗜好。高粱，一种重要的五谷杂粮，在本草纲目中有“温中，涩肠胃，止霍乱”的功能，越来越受到人们的青睐。但高粱中含有大量的多酚氧化酶，导致高粱食品褐化。如何控制这种褐化，就与人们对多酚氧化酶的认识有重大联系。
2009年，美国科学家完成了高粱基因组的测序，这为深入开展高粱重要农艺性状的基因和功能带来了契机。下面就对多酚氧化酶的研究展开论述。
1.1多酚氧化酶简介
多酚氧化(PPO, EC1.10.3.1)包含两个铜离子结构域，PPO的活性位点位铜离子结构域中，包含六到七个组氨酸残基和一个高度保守的半胧氨酸残基。其广泛分布十动物、植物、真菌和细菌中，在真菌中经常被叫做酪氨酸酶。PPO在小分子氧的参与下能够催化酚类物质氧化成醒类物质，这些醒类物质进一步与色素物质结合，使植物表现出褐化的现象。在高等植物中PPO在植物的生长过程中起到很多重要的作用，对外界环境的刺激能够做出反应，例如在影响谷物的穗和籽粒的褐变，抵御害虫和病原体的侵袭。由PPO造成的褐化反应在许多农作物的外表和加工过程中品质方面具有重要的影响，例如在小麦籽粒中，褐化严重影响了面制食品的品质
近来，关十PPO同工酶的分离已经有很多在单子叶和双子叶植物中的报道。在目前研究过的关十PPo的物种中，PPo以基因家族的形式存在。另外，最近的关十面包小麦，茄子和白杨木的研究中，发现PPo家族的不同成员在同一种植物和再生组织中，具有时间和空间特异性，并目‘能够对不同的环境的影响作出反应。目前关十PPO蛋白一级结构的研究中发现PPO包含一个信号肤、N-端结构域、推测的C_端结构域以及N-端和C_端的连接结构域信号肤将PPO定向运输到类囊体或者液泡腔内端结构域具有铜离子结构域、催化反应结构域(也就是铜A和铜B结构域)以及维持高级结构的重要氨基酸(例如酪氨酸修饰，互作结构域)，因此N-端结构域具有高度保守性。相比之下，连接区域大小和结构以及C-端结构域在不同的PPO中具有很大的变化
较强的抗旱性和较高的光合效率，使高粱成为重要的农作物和工业原料，
以提供食品，饲料并能作为能源物质。近来高粱基因组的测序，使的高粱口益成为研究基因和控制植物生长的生物反应及抵御环境胁迫的模式作物之一。目前关十高粱PPO的研究主要集中在生化和食品方面在分子方面的主要研究成果是关十蚜虫咬食后，PPo的表达量表现出明显的上调但是这种诱导上调的功能目前还不是很明确。
虽然近年来人们开始研究多酚氧化酶已经取得了一定的进展，但在多酚氧化酶的含量和功能之间的关系还不是很清楚。
1.1.1多酚氧化酶的结构和分子量
早在1998年Klabunde就对番薯PP。蛋白晶体进行了研究，后来人们进一步研究了链霉菌属中的PP。蛋白晶体结构，但是在真菌中还没有相关方面的报道。CuA与二个组氨酸残基和一个半胧氨酸残基之间存在联系，CuB是4个组氨酸残基的配体，其中第四个组氨酸是最近新报道的。利用基因定点诱变，研究这些活性氨基酸的功能，各种PPO的特性不但与PPO的氨基酸序列之间的多样性有关，而与高度保守序列的一些差异不无关系。
第三章 多酚氧化酶基因的生物............. 27-38
3.1 引言............. 27
3.2 多酚氧化酶基因的生物............. 27-28
3.2.1 查找高粱多酚氧............. 27
3.2.2 验证高粱多酚氧化酶............. 27-28
3.3 与玉米同源基因的............. 28
3.4 对多酚氧化酶的............. 28
3.5 结果和分析............. 28-36
3.5.1 高粱多酚氧化酶基因............. 28-29
3.5.2 高粱多酚氧化酶预测.............29-33
3.5.3 玉米同源基因的............. 33
3.5.4 多酚氧化酶的............. 33-36
3.6 结论与讨论............. 36-38
第四章 高粱籽粒多酚氧............. 38-44
4.1 引言............. 38
4.2 方法............. 38-39
4.2.1 RNA 的提取............. 38
4.2.2 cDNA 第一链合成............. 38
4.2.3 幼苗中的 ............. 38
4.2.4 特异引物的设计............. 38
4.2.5 引物的扩增效率............. 38-39
4.2.6 实时荧光定量............. 39
4.3 结果分析............. 39-43
4.3.1 特异引物............. 39-40
4.3.2 特异引物的扩增............. 40
4.3.3 幼苗中的多酚氧化酶............. 40
4.3.4 高粱多酚氧化酶............. 40-43
4.4 结论与讨论............. 43-44
总结论
本研究高粱PPO我们在基因组水平上和转录本水平上对SbPPO进行了系统的研究。
在基因组水平上对高粱多酚氧化酶基因的研究发现:
通过分析高粱品系BTx623中的全基因组信息，鉴定出8条SbPPO。这8条SbPPO分别定位在高粱3号染色体(SbPP01和SbPP02), 6号染色体(多SbPP03和I4) , 7号染色体(SbPP05-7)和10号染色体(SbPP08。其中SbPP06-8不含内含子，SbPP01, 2和5包含1个内含子，SbPP03和4含有2个内含子。这些SbPPO的预测蛋白(PPO1-8)都包含两个核基因编码的完整的铜离子结构域。在铜离子结构域中都含有酶活性结构氨基酸，酪氨酸修饰和其他互作氨基酸残基。SbPP02-7中含有类囊体转移结构域，然在SbPP01和8中预测到将目的蛋白定位在特定部位的N-端信号肤。系统进化树分析，发现高SbPPO与玉米的PPO亲源关系较近。通过线性分析我们能够鉴定出SbPP02-8在玉米中的同源基因。
