近年来感染率有逐步增加的趋势｡肺炎克雷伯菌是儿科患者中最常见的革兰阴性致病菌之一,其所致的院内感染可引起肺炎､伤口感染､尿路感染及菌血症等疾病,产β-内酰胺酶是肺炎克雷伯菌耐β-内酰胺类抗生素最常见的机制｡β-内酰胺酶相关基因赋予细菌编码对应酶的能力,而质粒介导的耐药性基因易于在细菌间传播,在临床上占有重要的地位｡β-内酰胺酶的种类多样,按其水解底物分类可分为青霉素酶､头孢菌素酶和碳青霉烯酶等,其对不同抗生素的水解能力有很大差异,对产酶株进行基因分型可为临床选用相应抗生素提供参考依据｡本研究收集2012-2015年本院儿科住院患者150株肺炎克雷伯菌分离株,检测其携带的β-内酰胺酶基因类型,为进一步研究和控制细菌耐药性提供依据｡
1材料与方法
1.1菌株来源
在本院分离的肺炎克雷伯菌中,产ESBL的菌株比例达到58.7%,这与广东省其他地区已报道的结果相比较一致｡选择2012年5月-2015年5月本院行微生物培养检查的儿科患者标本,标本类型包括痰液､尿液､血液､胸腹水和伤口分泌物等,收集患者培养肺炎克雷伯菌分离株共150株,剔除1年内同一患者相同感染部位的重复分离株｡
1.2菌株培养､鉴定及药敏试验
各种培养标本按《全国临床检验操作规程》接种和培养,并采用VITEK2全自动微生物生化鉴定仪(生物梅里埃)对细菌进行鉴定,同时采用VITEK Compact微生物药敏仪和纸片扩散法检测细菌对多种抗生素的耐药性,药敏结果判断参照美国临床和实验室标准化委员会(CLSI)药敏试验执行标准｡
1.3细菌
DNA模板的提取从低温冰箱取出保存的菌种,置室温融化后接种于M-H普通琼脂平板,于35℃培养箱内培养18~24 h｡挑取单个菌落于300μl无菌双蒸水,于100℃水浴10 min后,离心取上清作为模板DNA,于-20℃放置备用｡
1.4β-内酰胺酶基因的PCR检测
β-内酰胺酶基因检测采用PCR的方法,共检测TEM､SHV､CTX-M､DHA､PER､IMP､VIM和KPC等8种基因型,按文献报道序列进行引物合成｡PCR反应体系总体积为20μl,包括各种引物各1μl,DNA模板1μl,PCR酶混合物(Takara)10μl,并用双蒸水补至20μl｡反应条件为预热变性94℃5 min,94℃变性30 s,按对应退火温度退火30 s,72℃延伸1 min循环35周期,最后一个72℃延长至7 min｡所有PCR反应以大肠埃希菌ATCC25922 DNA为阴性对照,PCR产物在2%琼脂糖凝胶,0.5 TBE缓冲液中电泳40 min,溴化乙锭溶液染色后进行凝胶成像｡
1.5 PCR产物测序与分析
PCR产物用纯化试剂盒(天根)进行纯化,并送上海生工公司进行DNA序列测定,数据用BLAST网上工具进行分析比对｡
2结果
2.1菌株分布
150株肺炎克雷伯菌中,2012-2015年的分离比例分别为18.7%(28/150)､30.0%(45/150)､35.3%(53/150)､16.0%(24/150)｡150株菌株分别分离自痰液､尿液､血液､胸水､腹水和伤口分泌物等标本,在上述标本中的分离率分别为42.7%(64/150)､18.0%(27/150)､14.7%(22/150)､12.7%(19/150)､8.0%(12/150)､6.0%(9/150)｡
2.2耐药性分析
150株肺炎克雷伯菌中,产超广谱β-内酰胺酶(ESBL)菌株88株,占比58.7%｡总体耐药性方面,本研究中菌株对青霉素类和头孢菌素类药物耐药性较强(耐药率44%以上),对喹诺酮类药物的耐药率同样较高(46%~48%),对氨基糖苷类的敏感性则较高,对碳青霉烯类药物耐药率则很低｡
2.3β-内酰胺酶基因的PCR检测
在8种检测的β-内酰胺酶基因中,有4种(bla CTX-M､bla TEM､bla SHV和bla DHA)在研究菌株中被检出,PCR产物测序和序列分析结果与扩增结果相符｡其中阳性率最高的为bla CTX-M基因,占比47.3%(71/150);bla SHV的阳性率为38.6%(58/150);bla TEM基因则为31.3%(47/150);比例最低的为bla DHA基因,阳性率仅为3.3%(5/150)｡未检出含bla PER､bla IMP､bla VIM和bla KPC的肺炎克雷伯菌分离株｡这些耐药基因绝大部分被ESBL阳性菌株所携带,仅有1株ESBL阴性菌株携带bla DHA基因｡
2.4多种β-内酰胺酶基因共存情况
150株肺炎克雷伯菌中有34.7%(52/150)的菌株携带两种耐药基因,8.7%(13/150)的菌株携带3种耐药基因,尤其值得注意的是,有1株菌株携带全部4种耐药基因｡
3讨论
肺炎克雷伯菌是儿童呼吸道感染､泌尿系统感染和血流感染的最常见病原菌,本研究中,这三种感染标本类型分离得到的菌株比例达到75%以上,可见其在临床感染病例中的广泛性｡头孢菌素类药物常用于儿科住院患者的抗肺炎克雷伯菌感染治疗,其毒性低､抗菌谱广泛的特点使得儿科医生在患者中大量甚至长期应用,这使得耐药菌株迅速在儿科病房中流行,尤其是产ESBL的菌株｡
耐药性方面,分离菌株的三代头孢类药物的耐药均在40%以上,这些耐药菌株对喹诺酮类和氨基糖苷类等常用药物耐药性也较高,这表明产酶株本身可能存在多种抗生素交叉耐药的机制｡
β-内酰胺酶基因的检测结果发现,肺炎克雷伯菌携带bla CTX-M､bla SHV､bla TEM和bla DHA等4种,与其它地区的研究结果相符｡研究表明,这些β-内酰胺酶基因可分布于多种可转移质粒上,通过接合等方式在不同细菌间迅速传播,引起这些基因的广泛扩散｡在广东地区,CTX-M型酶是分布比例最高的一种β-内酰胺酶,该种酶类对头孢噻肟和头孢曲松有很高的水解能力,但对头孢他啶的水解能力较差,这也与其耐药表型相符｡虽然发现了耐碳青霉烯类药物的菌株,但并未检出VIM､IMP和KPC等碳青霉烯酶基因,说明其碳青霉烯耐药性可能与其他因素有关｡
本研究还发现肺炎克雷伯菌菌株中普遍存在两种或以上β-内酰胺酶基因共存的情况,这使得产酶菌株对几乎所有的β-内酰胺类药物产生严重的耐药性,这使得临床对抗生素的选择更为困难｡临床抗菌药物的不合理使用不仅促进了产酶株的出现和流行,更使这些耐药基因在持续的抗生素压力下不断集中,出现同一个细菌携带很多耐药基因,甚至发展成泛耐药的“超级细菌”｡因此,儿科临床上应注意合理使用抗生素,减少不必要的预防性用药,注意进行耐药性的定期监测,采取积极有效的医院感染控制措施,严格遵守环境消毒卫生规范,以减少产β-内酰胺酶特别是同时产多种酶菌株的出现和传播｡
参考文献(略)
