本文是一篇植物学论文，本文对拟南芥 VQ 蛋白的研究发现其在植物生长发育及响应逆境胁迫中都具有非常重要的作用。但是到目前为止，关于 AtVQ3 基因的功能及作用机制仍属未知。近年来，我们实验室对 VQ 基因做了大量研究工作。其中对 AtVQ3 基因的研究发现其转录表达受到高温、高盐等逆境胁迫的显著诱导。进一步通过 RNAi抑制等技术研究发现，AtVQ3 基因除了调控植物对热胁迫的抗性，对于植物的器官发育同样发挥作用。对野生型（WT）和过量表达 AtVQ3（35S:AtVQ3）基因拟南芥的转录表达谱进行分析发现，在拟南芥中过量表达 VQ3 基因可显著促进94 个基因的上调表达，其中 At2g18680 上调最为显著，比野生型拟南芥上调 360多倍，并且进一步的研究发现该基因的启动子区含有 W-box（TTGACC）序列。W-box 作为 WRKY 转录因子结合的顺式作用原件，通过与它结合来发挥作用。VQ 蛋白作为辅助转录因子可以与 WRKY 蛋白形成复合蛋白对下游的基因进行调控。因此我们推测 At2g18680 基因可能是受 VQ3 蛋白调控的下游靶基因，因此我们对其展开研究。
第一章 文献综述
1.1 VQ 蛋白及其编码基因的研究进展
拟南芥在受到外界环境胁迫时，有许多逆境蛋白产生，其中 VQ 蛋白是一种非常重要的逆境蛋白[1, 2]。
VQ 蛋白是一类与生长发育相关的特异性转录调控辅助因子，除此之外它还能调控植物响应环境胁迫。VQ 蛋白具有一段高度保守的氨基酸序列，即 VQ 结构域（FxxxVQxLTG，F：苯丙氨酸，V：缬氨酸，Q：谷氨酰胺，L：亮氨酸，T：苏氨酸，G：甘氨酸，x 代表任意氨基酸)。2002 年在拟南芥(Arabidopsis thaliana)中首次发现 VQ 蛋白[3]，随后在多种作物中发现了 VQ 蛋白，包括：水稻(Oryza sativa)[4]、玉米(Zea mays)[5]、大豆(Glycine max)[6]、棉花(Gossypium L.)[7]、葡萄(Vitis vinifera)[8]等物种。目前为止 VQ 基因家族在拟南芥中共鉴定出 34 个成员，对其进行功能分析发现：VQ 蛋白除了参与植物对外界的胁迫应答以外[9, 10]，还对植物的生长发育有所调控[11]。
1.1.1 VQ 蛋白及其编码基因的结构特点
为了了解 VQ 蛋白的结构特点，前人分析了拟南芥整个家族中 34 个基因所编码的蛋白质中 FxxxVQxxLTG 基序[12]（表 1）。大多数拟南芥 VQ 基因不存在内含子，并且编码的蛋白质相对较小，其氨基酸残基的数目大多都少于 300。VQ2是最大的 VQ 蛋白具有 430 个氨基酸残基，编码基因含有四个内含子区域[4, 13]。VQ2 与 VQ3 的 N-末端区域大约具有 240 个氨基酸高度同源，VQ3 由染色体 I 上与 VQ2 相邻的基因所编码[13]（图 1）。
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1.2 WRKY 转录因子及其编码基因的研究进展
目前已被广泛接受的 WRKY 分类系统是在 2000 年基于拟南芥基因家族的基因组特征而建立的[23]。根据这一分类，植物中的 WRKY 基因根据 WRKY 结构域的数目以及锌指结构的特征[23]分为以下三族：I，II 和 III，其中根据它们的系统发育关系，II 组 WRKY 可以进一步划分为五个亚族，即：IIa，IIb，IIc，IId和 IIe[23]。I 族中 WRKY 蛋白包含两个 WRKY 保守结构域，II 族和 III 族仅含有一个。其中，I 族和 II 族 WRKY 蛋白锌指基序结构为 C-X4-5-CX22-23-H-X1-H，III 族锌指结构为 C-X7-C-X23-H-X-C[24]。
最初人们认为 WRKY 基因是植物所特有的一类调控基因[25]。对其他类群的广泛研究发现，WRKY 基因也存在于其他的真核生物中，如真菌界、变形虫界、双滴虫类和黏菌类[26-28]。根据 WRKYs 的分布模式，推测植物 WRKYs 起源于多种古老的基因转移事件[28]。之后的研究表明，在绿藻中只含有 I 族 WRKYs，而II 族是在陆生植物的共同祖先中进化的，而 III 族 WRKYs 只出现在种子植物的共同祖先中[26]。从更多的藻类和更详细的分析中发现，亚族 IId 可以追溯到一种原始序列，即名为 K. nitens 的轮藻植物中[28]，IIa 则起源于种子植物。随后人们提出了关于 WRKY 基因家族进化的两种假说[28]：(i)所有 WRKY 基因都来源于 I类 C 末端 WRKY 结构域;(ii)亚族 IIa 和 IIb 直接从一个海藻的 WRKY 基因祖先进化而来，该基因具有一个独立的结构域，并与 I 族衍生的谱系分离[26-28]。
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第二章 拟南芥 AtVQ3 基因的功能分析
2.1 实验材料
2.1.1 植物材料及菌株
1) 拟南芥(Arabidopsis thaliana.L)哥伦比亚野生型及本氏烟草，由本实验室保存。
2) 大肠杆菌菌株 DH5α，购于青岛擎科生物有限公司；农杆菌菌株 GV3101，由本实验室保存。
2.1.2 载体质粒及引物
1) 质粒载体：AtU6-26-sgRNA-SK，
pCAMBIA2300GFP 和 pCAMBIA1300-pYAO:Cas9 由本实验室保存，pMD18-T-vector 购于大连 Takara 公司。
2) 扩增目的基因所需引物（表 2）。
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2.2 实验方法
2.2.1 拟南芥基因组 DNA 提取
1) 取植物组织 30mg 于研钵中，加液氮充分研磨；
2) 1.5ml 离心管中加入 700μl CTAB 提取液；
3) 将研磨好的粉末转移到 1.5ml 的离心管，涡旋振荡 1min 充分混匀，65℃水浴 30min，12000rpm 室温离心 15min；
4) 取上清 700μl 转移至新的 1.5ml 离心管中，加入 700μl 氯仿：异戊醇混合液（按 24：1 进行混合）颠倒混匀 3min，12000rpm 室温离心 15min，吸取上层水相于一新的 1.5ml 离心管中，重复此步骤；
5) 向吸取上清的离心管内按 10：7 比例加入异丙醇，颠倒充分混匀，静置10min，室温 12000rpm 离心 10min，倒掉上清；
6) 加入 70％的乙醇 700μl 后，将沉淀重悬起来，7500rpm 室温离心 3 分钟，去除上清，重复此步骤；
7) 室温 12000rpm 离心 20s，用移液枪吸取残液，置于旋转蒸发仪（60℃）内2min；
8) 加入 150μl 含 RNA 酶的无菌水将沉淀溶解，于-20℃冰箱内保存。
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第三章 VQ3 蛋白与 WRKY 转录因子的作用机制 ........................... 29
3.1 实验材料 ........................... 29
3.1.1 植物材料及菌株及载体质粒 ............................. 29
3.1.2 载体质粒及引物 ................................... 29
第四章 AtVQ3 候选靶基因（At2g18680）的功能分析 .......................................... 40
4.1 实验材料 .................................... 40
4.1.1 植物材料及菌株 ............................. 40
4.1.2 载体质粒及引物 ........................... 40
第五章 讨论与结论 ............................. 51
第四章 AtVQ3 候选靶基因（At2g18680）的功能分析
4.1 实验材料
4.1.1 植物材料及菌株
参照 2.1.1 4.1.2 载体质粒及引物
1） 质粒载体：pCAMBIA2300GFP，AtU6-26-sgRNA-SK 和 pCAMBIA1300-pYAO:Cas9 由本实验室保存，pMD18-T-vector 购于大连 Takara 公司。
2） 通过 tair 网站，获得 At2g18680 基因的 CDS 序列，使用 Primer 5.0 软件设计扩增所需的上下游引物。（表 4）
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第五章 讨论与结论
对拟南芥 VQ 蛋白的研究发现其在植物生长发育及响应逆境胁迫中都具有非常重要的作用。但是到目前为止，关于 AtVQ3 基因的功能及作用机制仍属未知。近年来，我们实验室对 VQ 基因做了大量研究工作。其中对 AtVQ3 基因的研究发现其转录表达受到高温、高盐等逆境胁迫的显著诱导。进一步通过 RNAi抑制等技术研究发现，AtVQ3 基因除了调控植物对热胁迫的抗性，对
