1.1 研究背景
目前，人工授精技术是养猪化生产中使用最广泛而且最有效的配种方法，且精液的保存技术也越来越受到重视。只有不断提高猪精液的保存效果，猪人工授精技术才能发挥更大作用。猪的人工授精，就是利用器械采集公猪精液，再使用器械把经过检查和处理的精液输送到母猪生殖道的适当部位，从而使其受孕的一种方法。这种方法不但可以减少饲养人员，防止疾病的传播，还可以提高养殖效益和家畜重要遗传物质的利用率，对养猪生产具有重要的推动作用。猪人工授精所用的精液主要来源于新鲜精液，另外还有低温保存和冷冻保存的精液，因为低温和冷冻保存的精子活力较低，导致母猪繁殖成绩不理想，所以猪人工授精的精液还是以常温保存的鲜精为主。据估计，在全世界范围内的人工授精中，使用当天或保存 1-5 天的公猪精液占 99%以上，而使用保存 1-2 天的精液占 85%。进入二十一世纪，我国市场经济不断升级，我国养猪行业面临着食品监督安全和猪病防控的迫切要求，养殖户面临着由散养转型为规模化、合作化养殖的压力，同时我国的猪肉产品有着低于国外的价格优势，因此人工授精技术在国内养猪生产中占据了更加重要的地位，对猪精液的保存技术也有了更高标准的要求，该技术越成熟，越能提高人工授精的效果。猪精液的保存分为常温保存（15-20℃）、低温保存（0-5℃）以及液氮冷冻保存（-196℃），前两者属于液态短期保存，后者属于固态长期保存。对于精液的保存技术，公认的观点是通过稀释液中的有效成分抑制或降低精子的新陈代谢来延长精子的体外存活时间。为了突破猪人工授精的瓶颈，以及解决遗传育种上远距离运输、长时间保存和保护优秀遗传物质等问题，猪精液的低温保存以及冷冻保存技术被提出并使用了，常温保存时间短但是浪费大，低温保存时间长而且经济适用，冷冻保存为人工授精提供了所需的精子库，但由于猪精子的抗冷性比较差，所以这两项技术目前还未成熟，依然处于试验阶段。因此，对猪精液的低温以及冷冻保存进行更系统、更深入的研究具有非常重要的意义。
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1.2 猪精液常温保存的研究进展
猪精液的常温保存是指在 15～25℃的保存。目前养猪生产上常保存在 17℃的恒温箱中。为了实现其保存功能，稀释液中必须含有能维持精子新陈代谢的营养物质（单糖如葡萄糖和果糖）、防止细胞冷休克的冷冻保护剂（牛血清白蛋白，白蛋白）、调节pH 值（碳酸氢钠 Tris、HEPES）和渗透压（氯化钠、氯化钾、钠柠檬酸）的物质、抑制微生物生长的抗生素等（如卡那霉素或庆大霉素）[1]。哺乳动物特别是公猪的精子由于其细胞膜的特性，使其对冷冲击非常敏感[6]。对于精液常温保存的合适温度，学者做了大量的研究。有学者在 5～8℃下进行猪精液保存研究，结果发现受胎率和胚胎存活率都呈现明显的下降[7]。鲜红等[8]在试验中发现，猪精液常温保存的适宜温度范围为 14～18℃，此外他们的研究总结出，15℃是鲜精冷休克的临界温度，新鲜猪精对 15℃以上的温度不敏感，若周围环境温度快速下降到 15℃以下，精子则会呈现出冷休克现象，造成各种损伤。目前，大多数人比如 Johnson[9]等认为，15～18℃为猪精液常温保存的理想温度，养猪生产上使用的常温精液均保存在 17℃。
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2 不同保护剂及稀释液 5℃保存对猪精液品质的影响
前言
猪精子膜的特殊性结构，造成猪精子对低温比较敏感，精子容易冷休克以及丧失活力，这与其细胞膜的脂类双分子层的组成息息有关，因此低温保存很少应用在实际生产上，至今还是停留在研发稀释液的配方阶段。目前采用的公猪精液低温稀释液多种多样，但就其化学组成上来看，主要包含营养代谢物质、低温保护剂、缓冲剂、抗生素以及大分子物质等。精子在低温保存过程，由于遭受低温打击，细胞内产生了较多的高活性分子，促使氧化与抗氧化作用之间失去平衡，对精子造成不同程度的损伤，主要包括脂质过氧化、精子细胞膜破坏、顶体等受损，影响精子品质。因此，开发和利用新的低温保护剂，降低和避免精子在低温中所受到的损害，提高精子品质，已成为人们研究的重点之一。本试验中，是以长白公猪精液为试验对象，以雌二醇、睾酮、黄体酮、ATP、BSA为添加剂，分别以不同浓度加入 Tris 卵黄稀释液、Modena 稀释液、Modena+sk 稀释液中低温保存，进行最佳添加剂、最有效添加浓度、以及最佳稀释液的筛选。
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2.1 试验材料
2.1.1 公猪精液来源
新鲜公猪精液来自某种猪场同一头长白公猪，种公猪健康强壮，生殖能力正常，精子活力 0.9 以上，为了保证公猪精液品质，猪场内另外安排 2 头健壮种公猪作为后备试验精液。
2.1.2 主要仪器和设备
烧杯、试管、移液枪、超纯水制备仪、磁力搅拌器、低温高速离心机、恒温水浴锅、显微镜、血细胞计数板、冰箱、电子分析天平。
2.1.3 主要试剂和药品
Tris 卵黄稀释液、雌二醇、睾酮、黄体酮、ATP、BSA(牛血清蛋白)、脱脂乳(sk)、HOST 染色液。
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3 不同浓度甘油和卵黄以及不同糖类对猪精液冷冻保存的影响..............18
3.1 试验材料 ...........18
3.1.1 公猪精液来源.........18
3.1.2 试剂与设备.............18
3.2 试验方法 ...........19
3.3 试验设计 ...........20
3.4 试验结果 ............20
3.5 分析与讨论 .......21
3.6 小结 .......22
4 猪冷冻精液人工授精的应用效果..............23
4.1 试验材料 ...........23
4.1.1 冷冻精液来源.........23
4.1.2 母猪来源.....23
4.1.3 主要设备与仪器.....23
4.2 试验方法 ...........23
4.3 试验设计 ...........24
4.4 试验结果 ...........24
4.5 分析与讨论 .......25
4.6 小结 .......26
5 结论..............27
5.1 不同保护剂及稀释液 5℃保存对猪精液质量的影响 .............27
5.2 不同浓度甘油和卵黄以及不同糖类对猪精液冷冻保存的影响 ........27
5.3 猪冷冻精液的人工授精应用效果 ........27
4 猪冷冻精液人工授精的应用效果
前言
人工授精技术是一项十分成熟的繁殖技术，在养猪生产中普遍使用，但由于常温精液不利于长期保存及长途运输，在使用上产生了一定局限性，因此海内外专家一直致力于研究猪精液的冷冻保存技术。由于猪精子对低温特别敏感，这一项技术一直没有大的突破，仍然处于稀释液的研究阶段，冻精始终未能达到常温精液一样的繁殖效果，这依然是全世界养猪业面临的一个难题。目前猪冻精应用率在全世界人工授精占不到 1%，这个比例在许多年里将都没有大的变化。为了探索冻精在规模化猪场中的使用效果，攻克世界性难题，实现猪冻精的普及，本试验以长白、大白、杜洛克母猪为实验对象，分别使用鲜精与冷冻精液进行人工授精对比试验，从精子品质、受胎率、分娩率、窝均产仔数、窝均活仔数这 5 项指标中进行比较，探讨冷冻精液在规模化生产中的使用效果，为冻精的推广提供指导依据。
结论
在 Tris 卵黄稀释液中，10ug/ml 雌二醇、20ug/ml 睾酮、80ug/ml 黄体酮、0.025、0.05mg/ml ATP、0.05、0.1mg/ml BSA 是改善低温保存效果的最有效浓度，其中保存效果最好的是 80ug/ml 黄体酮。保存效果最好的稀释液是 Modena+sk 稀释液，其次是 Tris 卵黄稀释液，最后是Modena 稀释液，其中以 Modena+sk+0.05mg/mlBSA(P＜0.05)的组合对猪精液 5℃保存的改善效果最好。脱脂乳可以作为保护剂替代蛋黄添加在低温保存稀释液中使用。长白猪精液在本次试验中，添加 3%的甘油对精液品质具有明显的改善，过多的甘油也体现出其毒性作用，其余甘油浓度对精液品质无改善甚至接近死亡。添加 20%含量的卵黄对精液品质具有明显的改善，浓度添加过多或过少均表现出较低的精液品质，其余浓度的卵黄对精液品质体现出较差的效果。添加海藻糖与果糖对精液品质的改善比其余糖类的改善效果要好，其中蔗糖与乳糖的改善效果无明显区别，葡萄糖对精液品质的改善效果最差。
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参考文献（略）
