本文是一篇医学论文，笔者通过体内和体外感染模型，探讨了基因hly、llsB在肠道中所发挥的毒力作用，表明Lm对肠道屏障的紧密连接具有病理损伤作用。
第1章绪论
1.1研究目的及意义
单核细胞增生性李斯特菌（Listeria monocytogenes，Lm），是重要的人兽共患病原体，当该菌进入人和动物的机体后，会引起一种会威胁生命的疾病，称为李斯特菌病。Lm经口摄入污染物，如牛奶和奶制品、肉类、蛋类[1]等进入肠道继而引发对宿主的感染，感染后的主要症状为败血症、脑炎、脑膜炎、流产、死产、胃肠炎等，虽然婴幼儿、孕妇、以及免疫系统减弱的人容易感染，且感染率不高，但其死亡率可以高达20%-30%[2]，严重危害畜牧业生产和食品卫生安全。
Lm在入侵宿主后，毒力因子在黏附、侵袭等致病过程中发挥重要作用，因此研究Lm毒力因子的分子致病机理，有助于防控李斯特菌病。溶血素在Lm侵袭宿主过程中发挥着关键性作用，LLO是由hly基因编码的分泌性蛋白，是Lm逃逸吞噬体相关的毒力因子，缺失后能大大降低Lm在宿主细胞中的定殖，从而一定程度上减轻Lm的毒性。溶血素S是Lm的除溶血素O外的另一种溶血素，可以通过调节宿主肠道内的微生物菌群，进而使Lm进行大量增殖。目前关于溶血素基因LLO和LLS在感染小鼠肠道时发挥作用的具体机制尚不清楚。此外，胃肠炎是当今世界上发病率特别高的疾病之一，全国每年约有7.5亿人次发生急性胃肠炎,其中,约三分之一由食物引起。Lm作为可诱发急性胃肠炎的一种胞内寄生菌，被人体消化并吸收后到达胃肠道，突破胃肠道屏障进入肠道组织引发炎性细胞浸润、肠绒毛脱落以及血管充血等一系列肠道组织损伤。在之前对Lm的研究主要集中在血脑屏障（blood brain barrier，BBB），对引起肠道屏障的损伤研究较少，对具体的致病机制尚不清楚。
1.2国内外研究进展
1.2.1单增李斯特菌
单核细胞增生性李斯特菌（Listeria monocytogenes，Lm）属于革兰氏阳性胞内寄生菌。反刍动物主要通过口腔吞食已发霉或变质的青贮饲料感染李斯特菌，然后进行传播，青贮饲料有利于李斯特菌的生长繁殖，从而致使群体爆发[3-6]。李斯特菌可以在农村环境中存活和进行广泛的传播，因此会对所需的原材料以及生产工厂进行污染[7]。这些细菌可以在食品加工过程中生存[8-11],这就使得李斯特菌对食品安全问题构成严重威胁，2002年WHO将Lm列为仅次于大肠杆菌O157、志贺氏菌、沙门氏菌之后的第四大重要食源性致病菌[12]。
李斯特菌微生物的正式发现可追溯到1924年，当时D.Murray、R.A.Webb和M.B.R.Swann在英国剑桥的实验室分离出单核细胞增生李斯特菌，作为影响兔子和豚鼠的败血病的病原体[13]。1929年，丹麦报告了第一例人类李斯特菌病[14]，20世纪70年代末80年代初，关于分离李斯特菌的报告数量开始逐年增加[15-21]。最容易被污染的食品是软奶酪、烤肉、肉肠、腌菜、腌鱼、沙拉、熟食卤味及其一些开袋即食的冷藏食品[22-27]。李斯特菌病常在欧美发达国家集中暴发流行，早在2000年美国就将其确定为其国家法定染病进行严密监测，而在国内主要为零散的病例报告，我国于2011年建立的国家食源性疾病监测系统未将其列入我国法定传染病[28]。但是，李斯特菌感染引起的病死率居高不下，造成严重的医疗负担，在1983年的马萨诸塞州，由李斯特菌所感染的疾病，致使14人死亡；1985年，李斯特菌感染的干奶酪被人直接食用后，52人死亡；2011年的美国，被单增李斯特菌感染的哈密瓜被食用后，感染146人，其中致使30人死亡；2012年，意大利南部生产的一种意大利乳清干酪引发了美国14个州的多州疫情，共导致23例病例和5例死亡；2014年，丹麦有一家食品公司所生产的被李斯特菌感染的香肠被人食用后，致使37人死亡，其中主要是老人和病人；2018年，南非爆发的李斯特菌病，其中感染1060人，最终导致216人死亡；2019年，在德国被李斯特菌感染的香肠被人食用后，感染37人，死亡2人；2021年，美国生产的香瓜被李斯特菌污染后，造成150人感染，30人死亡。所以我们应加强对该菌感染的认识并进行积极预防和治疗。
第2章单增李斯特菌Δhly缺失株的构建以及Lm90SB2-Δhly、Lm90SB2-ΔllsB部分生物学特性
2.1材料与方法
2.1.1材料
2.1.1.1菌株和质粒
2.1.1.2主要试剂配制
（1）氯霉素-乙醇混合液（10 mg/mL）：称0.5 g氯霉素于50 mL 无水乙醇，0.22μm滤器过滤，分装并于-20℃保存。
（2）5×TBE核酸电泳缓冲液：Tris 27 g、硼酸13.75 g、EDTA 10 mL,溶于500 mL纯净水中，用前稀释20倍。
2.2结果与分析
2.2.1缺失株Lm90SB2-Δhly的构建
2.2.1.1 hly基因上下游臂及融合片段的扩增
以引物hly-P1和hly-P2扩增上游臂片段，hly-P3和hly-P4扩增下游臂片段，琼脂糖凝胶电泳在400bp和457bp处可以得到两条目的条带，与预期结果相同(图2-1)。将条带大小正确的产物进行回收纯化，然后融合上、下游臂，经PCR检测后得到一条长为857 bp的目的条带，与预期的条带大小相一致(图2-2)。
第3章Δhly、ΔllsB基因缺失对Lm90SB2毒力的影响.......................28
前言..........................................28
3.1材料与方法......................28
3.1.1材料....................................28
3.1.2方法......................................30
第4章Δhly、ΔllsB基因缺失对小鼠肠道组织屏障损伤机制研究..........................36
前言...................................36
4.1材料与方法.................................36
4.1.1材料......................................36
4.1.2方法..................................38
第5章结论.................................44
第4章Δhly、ΔllsB基因缺失对小鼠肠道组织屏障损伤机制研究
4.2结果与分析
4.2.1肠组织病理组织学观察
小鼠肠道组织病理切片结果显示：12-24 h时，病理变化最为明显（图4-1B，图4-1C，图4-1D），可观察到肠绒毛脱落；炎性细胞浸润，血管充血；绒毛高度下降（图4-1E，图4-1F，图4-1G，图4-1H）；缺失株Lm90SB2-Δhly、Lm90SB2-ΔllsB在感染小鼠肠道后，与亲本株Lm90SB2相比，肠绒毛脱落现象显著减轻（图4-1B，图4-1C，图4-1D），其中，llsB基因缺失后，肠绒毛脱落现象极显著减轻（图4-1D）。
第5章结论
本研究在Lm90SB2的基础上，构建单基因缺失株Lm90SB2-Δhly。①在不同的环境条件下，基因hly、llsB不发挥其调控作用。②溶血活性方面，Lm90SB2-ΔllsB相较于Lm90SB2溶血效价几乎无变化，Lm90SB2-Δhly基本无溶血现象。说明hly基因缺失后的菌株完全丧失溶血活性。③hly、llsB毒力基因的缺失对细胞侵袭力及小鼠致病性作用下降明显，进一步说明hly、llsB基因对Lm毒力发挥具有重要的存在意义。④小鼠感染Lm后，小鼠肠道黏膜屏障遭到损害，观察到肠黏膜脱落，腺体数量变少，炎性细胞侵润，血管充血，粘膜高度变短。⑤紧密连接蛋白ZO-1、Occludin和Claudin-5表达下调，表明Lm对肠道屏障的紧密连接具有病理损伤作用。
参考文献（略）
