苯丙氨酸解氨酶(Bhenylalanine ammonia-lyasePAL)是苯丙烷类代谢途径的关键酶和限速酶｡因此认为PAL活性变化和植物抗病性关系密切｡多数报道认为,PAL酶活与品种抗性呈正相关,并提出PAL可作为植物抗病性的一个生理指标｡也有一些报道认为,PAL酶活与抗性无关或呈负相关｡
POD能催化酚类物质氧化,是木质素合成的关键酶之一,同时在清除H2O2和OH-自由基方面具有重要的作用｡玉米纹枯病是我国玉米产区一种普遍发生的玉米病害,目前,对该病的病原学､发生规律､抗性评价和综合防治已有较多报道｡关于玉米自身抗病机制尤其在分子抗性机制方面的研究,国内外报道较少｡通过分析玉米接种纹枯病菌后,胼胝质和木质素的沉积情况､PAL酶活性和木质素含量的动态变化以及PAL､POD和PR-1基因的表达动态,阐述木质化在纹枯病抗性机制中的作用,初步揭示玉米与纹枯病菌亲和互作可能的防卫途径｡
1材料与方法
1.1玉米品种及菌株材料
玉米品种丹玉78,对纹枯病菌表现中等程度抗性,由山东省农业科学研究所提供｡菌株:Rhizoctoniasolani Kühn AG1-IA融合群,菌株号LY1-3-1,本实验室分离保存｡
1.2育苗及接种方法
玉米种子次氯酸钠表面消毒后播入有灭菌土的灭菌花盆内,25℃恒温室内生长至4~5叶期,采用牙签嵌入法接种,喷水保湿,于接种后不同时间取样｡以无菌牙签同样处理为对照｡
1.2.1组织病理学观察
胼胝质染色观察:参照Tosa等的方法并略作修改,取接种后20h玉米叶鞘,置于适量的卡诺固定液(甲醇∶冰乙酸=3∶1)固定约24h,用0.05mol/LK 3PO4缓冲液冲洗2~3次;将组织置于95%酒精中,沸水浴脱色15min,取出后用pH值7.5､0.01%的苯胺蓝染液染色5~10min;在Nikon-ECLIPSE90i荧光显微镜下观察(激发波长450~490nm)｡以未接菌玉米叶鞘为对照｡
木质素沉积观察:采用间苯三酚/浓盐酸法观察木质素的沉积,取接种后20h的玉米叶鞘,滴加几滴间苯三酚试剂(1g间苯三酚,溶于20mL95%乙醇),反应2~3min,再滴加几滴浓盐酸,然后于Nikon-ECLIPSE90i光学显微镜下观察｡以未接菌的叶鞘为对照｡
1.2.2苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性测定
依据薛应龙等方法,略有改动,分别测定接种纹枯病菌后0､12､24､48､72､96､120､144､168 h玉米叶鞘中的PAL酶活性,以每分钟OD 290增加0.01的酶量定为一个酶活单位U｡
1.2.3木质素含量测定
采用波钦诺克的碘量法测定｡分别于接种后0､12､24､48､72､96､120､144､168 h取玉米叶鞘组织1g,液氮研磨后称取0.05~0.1g粉末装入离心管,加入10mL 1%醋酸充分混匀,4℃､10000r/min离心10min,收集沉淀｡按照波钦诺克的实验程序依次加入各种反应液,将终反应液用0.1N的硫代硫酸钠滴定,滴定液使用量记录为b(mL);以清水同样处理为对照进行滴定,对照滴定液用量记录为a(mL)｡
1.2.4总RNA的提取及cDNA合成
采用Tranzol法提取总RNA,于接种后0､24､48､72､96､120h,在接种点周围取0.5~1cm2大小的叶鞘组织3~5g,依照Tranzol试剂盒说明书提取总RNA,用Utrospec 2100蛋白核酸定量测定仪测量RNA样品的浓度和纯度,以A260/A280比值衡量RNA样品的纯度,再进行甲醛变性琼脂糖凝胶电泳鉴定RNA完整性,最后利用反转录试剂盒合成第一链cDNA｡
1.2.5半定量RT-PCR
利用半定量RT-PCR检测基因表达动态变化,EF1a基因能够在真核生物体内稳定表达,可作为内参基因｡PAL､POD､PR-1和EF1a基因的引物序列及扩增片段长度｡PAL､POD､PR-1､EF1a基因的引物由上海生工生物技术有限公司合成｡
1.3生化试剂
RT-PCR及PCR试剂(10×Taq buffer､dNTP､Taq酶等)购于北京全式金生物技术有限公司;其他常规试剂均为进口及国产分析纯｡
苯胺蓝染色剂与细胞壁特异性结合,在蓝光激发下诱发胼胝质产生黄绿色荧光,呈现的荧光可反映胼胝质沉积情况｡在纹枯病菌(R.solani)胁迫下,玉米叶鞘组织的气孔保卫细胞及周围细胞壁部位均有明显的胼胝质的黄绿色荧光产生,未接种R.solani的健康叶鞘无胼胝质黄绿色荧光出现,表明R.solani胁迫诱导了玉米组织中胼胝质的沉积｡
2.2 R.solani胁迫下玉米叶鞘中木质素的沉积
间苯三酚与木质素结合后生成紫红色物质,呈现的颜色可反映木质素的沉积情况｡在纹枯病菌(R.solani)胁迫下,玉米叶鞘组织气孔保卫细胞及周围细胞壁部位均有明显的紫红色出现,未接种R.solani的健康叶鞘无此反应,表明R.solani胁迫诱导了玉米组织中木质素的积累｡2.3 R.solani诱导后PAL活性变化
PAL是苯丙烷途径的关键酶,与木质素的积累密切相关｡从接种R.solani后,PAL活性随时间的延长呈现一定的波动,在72h内呈升高趋势,72h达到第一个峰值,随后稍有下降,120h后又呈升高趋势,144､168h的活性比72h活性还要高｡
2.4 R.solani诱导后木质素含量变化
,玉米叶鞘接种R.solani后,木质素含量均高于对照,在96h内呈升高趋势,96h时达到含量峰值,其含量较对照高出2.45%,120h稍有下降,随后含量又有所升高｡总体看来,木质素含量变化与PAL酶活性变化趋势大致相同,都是先升高后降低再升高的趋势｡
RT-PCR结果表明,PAL､POD和PR-1均可诱导表达,但表达模式有所差异,即PAL在健康叶鞘中就有所表达,随着R.solani的诱导,表达量随增强趋势,48h达到表达峰值,随后呈下降趋势,在96h又达到一个小峰值,随之表达量又减弱;POD和PR-1的表达模式基本一致,即在健康叶鞘中没有表达,在接种24h后开始表达,48h达到表达峰值,随之表达量减弱,96h又出现一个表达量峰值,随之又呈减弱趋势｡
3结论与讨论
本研究采用组织原位染色､生化测定及RT-PCR等方法研究玉米纹枯病菌亲和互作早期胼胝质和木质素的积累,分析PAL酶活性及木质素含量及PAL､POD及PR-1的表达,结果表明,PAL酶活性变化与木质素含量及基因表达在时间上有相互关系｡木质素是一类结构复杂的聚合物,木质素的沉积被认为是植物对病原物侵染的抗性反应｡本研究发现,在发病初期,玉米接种点周围胼胝质和木质素等有明显的积累,表明这些物质参与了玉米对纹枯病菌的亲和互作｡
PAL是苯丙烷代谢途径的定速酶,在木质素及植物保卫素的合成中有重要作用,常被作为植物抗病反应的指标｡本研究发现,在感病初期玉米PAL活性变化不大,但接种后24~72h,PAL酶活性迅速升高,96h略有降低,144~168h又有明显升高,表明PAL可能参与了抗性反应,144~168h时因病害发展寄主组织逐渐干枯,PAL活性的变化可能与植株本身的衰老有关｡
研究认为,POD和PAL与抗病性有关｡本研究发现,PAL､POD及PR-1基因在玉米纹枯病菌亲和互作过程中的表达变化趋势基本一致,都在48h达到最大值,可能与寄主此时的抗病水平有关｡
参考文献:(略)
